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三种荧光定量PCR检测方法比较

三种荧光定量PCR检测方法比较

定量pcr：以参考物为标准，对PCR终产物进行分析或对PCR过

程进行监测，从而达成评定样本中靶基因拷贝数，称为定量PCR。定

量PCR可行性定量通常是在PCR扩增指数期进行。

常见荧光定量PCR检测方法可分为以下几类：

(1)SYBRGreenI检测模式

SYBRGreenI是一个能和双链DNA结合发光荧光染料。其和双

链DNA结合后，荧光大大增强。所以，SYBRGreenI荧光信号强度

和双链DNA数量相关，能够依据荧光信号检测出PCR体系存在双链

DNA数量。SYBRGreenI最大吸收波长约为

497nm，发射波长最大约为520nm。PCR扩增程序通常为

94℃～55℃～72℃三步法，40个循环。SYBRGreenI缺点：因为

SYBRGreenI没有特异性，不能识别特定双链，只要是双链就会结合

发光，对PCR反应中非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光，通常

本底较高，所以在临床上使用可能会有假阳性发生。

SYBRGreenI优点：SYBRGreenI优点是因为其缺点产生，因为

它能全部双链DNA相结合，所以对不一样模板不需尤其定制不一样特

异性探针，通用性很好，而且价格相对较低。这对科研是很有利，所

以中国外在科研中使用比较普遍。

(2)水解探针模式(taqman探针)

TaqMan探针是一个寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针5’末端，

而淬灭剂则在3’末端。当探针和靶序列配对时，荧光基团发射荧光因

和3’端淬灭剂靠近而被淬灭。在进行延伸反应时，聚合酶5’外切酶

活性将探针切断，使得荧光基团和淬灭剂分离，发射荧光。一分子产

物生成就伴伴随一分子荧光信号产生。伴随扩增循环数增加，释放出

来荧光基团不停积累。所以Taqman探针检测是积累荧光。PCR扩增

程序通常是：94℃～60℃40个循环。常见荧光基团是FAM，TET，

VIC，HEX。

(3)杂交探针模式(Beacon、FRET)

分子信标是一个呈发夹结构茎环双标识寡核苷酸探针，两端核酸

序列互补配对，所以标识在一端荧光基团和标识在另一端淬灭基团紧

紧靠近。荧光基团被激发后产生光子被淬灭剂淬灭，由荧光基团产生

能量以红外而不是可见光形式释放出来。分子信标茎环结构中，环通

常为15-30个核苷酸长，并和目标序列互补;茎通常5-7个核苷酸长，

并相互配对形成茎结构。荧光基团标识在探针一端，而淬灭剂则标识

在另一端。在复性温度下，因为模板不存在时形成茎环结构，当加热

变性会互补配正确茎环双链解开，假如有模板存在环序列将和模板配

对。和模板配对后，分子信标将成链状而非发夹状，使得荧光基团和

淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，因淬灭作用被解除，发出激发光

子。因为是酶切作用存在，分子信标也是积累荧光。常见荧光基团：

FAM，TexasRed。PCR扩增程序通常是：94～55～72℃三步法，

40个循环。

FRET探针又称双杂交探针，FRET探针由两条相邻探针组成，在

一条探针5`端标识FAM荧光基团，另一探针3`端标识Red640荧光

基团。当复性时，探针结合在模板上，FAM基团和Red640基团相邻，

激发FAM产生荧光，作为Red640基团激发光被吸收，使Red640发

出波长为640荧光。当变性时，探针游离，两基团距离远，不能产生

640波长荧光。因为FRET探针是靠近发光，所以检测信号是实时信号，

非