理性阐述qPCR实验的Ct值的合理范围。（附Ct值过大或过小的解决方法）.pdf

理性阐述qPCR实验的Ct值的合理范围。（附Ct值过大或过

小的解决方法）

Ct值是什么？Ct值具有什么样的作用？Ct值的正常范围是多少？

Ct值太大或者太小的原因？

Ct值是荧光定量PCR最重要的结果呈现形式。它被用于计算基因

表达量差异或者基因拷贝数。那么荧光定量的Ct值多大可被认为是合

理？如何保证Ct值的有效范围呢？今天就让小编来为大家解答这个问

题。Ct值是什么？qPCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定

的荧光阈值时的所对应的扩增循环数（CycleThreshold）。C代表

Cycle，T代表Threshold。简单讲，Ct值就是qPCR中起始模板扩增

达到一定产物量时，所对应的循环数。所谓“一定产物量”后续作进

一步解释。

Ct值有什么作用？1.指数扩增、模板量与Ct值的关系理想情况下，

qPCR中的基因经过一定的循环数被指数扩增而积累，扩增循环数和产

物量之间的关系是：扩增产物量=起始模板量×（1+E）循环个数。

n

然而qPCR反应并不是一直处于理想情况下，当扩增产物量达到“一

定产物量”时，此时循环个数为Ct值，处于指数扩增时期。Ct值与起

始模板量的关系：模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性

关系。起始模板量浓度越高，Ct值越小；起始模板量浓度越低，Ct值

越大。

2.扩增曲线、荧光阈值与一定产物量qPCR扩增产物量是以荧光信

号的形式直接呈现，也就是扩增曲线。在PCR早期，扩增处于理想情

况下，循环数较少，产物积累少，产生荧光的水平不能与荧光本底背

景明显地区别，之后荧光的产生增加进入指数期。可以在PCR反应刚

处于指数期的某一点上来检测PCR产物的量，以此作为“一定产物

量”，并且由此来推断模板最初的含量。因此，一定产物量对应的荧

光信号强度，也就是荧光阈值。

在PCR的后期，扩增曲线不再呈现指数扩增，进入线性期和平台

期。

3.Ct值的重现性

PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增

期，此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不

同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。

Ct值的范围？

1.扩增效率En

PCR扩增效率是指聚合酶把待扩增基因转变生成扩增子的效率。

由1个DNA分子转变生成2个DNA分子时的扩增效率为100%。扩

增效率常用En表示。为了方便后续文章的分析，简要介绍下影响扩增

效率的因素。

影响因解释如何判定？

素

1.可通过测定

1.模板RNA中可能含有抑

A260/A280和

制PCR反应的物质，如蛋

A260/A230比值或RNA

白质或去污剂等。

电泳，判断是否存在

A.PCR抑

污染。

制剂2.反转录后的cDNA中含

有高浓度的模板RNA和反

2.反转录后cDNA是否

转录试剂成分，也可能