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高效液相色谱实验

高乃群

实验目的：1进一步理解高效液相色谱的基本原理；

2熟悉高效液相色谱仪器的构成；

3了解影响高效液相色谱分离的主要操作参数。

实验原理：

1.基本原理

在互不相溶的两相——流动相和固定相的体系中，当两相作相对

运动时，第三组分（即溶质或吸附质）连续不断地在两相之间进

行分配，这种分配过程即为色谱过程。由于流动相、固定相以及

溶质混合物性质的不同，在色谱过程中溶质混合物中的各组分表

现出不同的色谱行为，从而使各组分彼此相互分离，这就是色谱

分析法的实质。也就是说，当一种不与被分析物质发生化学反应

的被称为载气的永久性气体（例如H、N、He、Ar、CO等）

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携带样品中各组分通过装有固定相的色谱柱时，由于试样分子与

固定相分子间发生吸附、溶解、结合或离子交换，使试样分子随

载气在两相之间反复多次分配，使那些分配系数只有微小差别的

组分发生很大的分离效果，从而使不同组分得到完全分离，例如

一个试样中含A、B二个组分，已知B组分在固定相中的分配系数

大于A，即KK，如图1-1所示。

BA

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当样品进入色谱柱时，组分A、B以一条混合谱带出现，由于组分B

在固定相中的溶解能力比A大，因此组分A的移动速度大于B，经过

多次反复分配后，分配系数较小的组分A首先被带出色谱柱，而分配

系数较大的组分B则迟被带出色谱柱，于是样品中各组分达到分离的

目的。设法将流出色谱柱某组分的浓度变化用电压、电流信号记录下

来，便可逐一进行定性和定量分析。

2.高效液相色谱法的分类及其分离原理

液-固色谱法液—液色谱法离子交换色谱法凝胶色谱法

a.液-固色谱法（液-固吸附色谱法）

固定相是固体吸附剂，它是根据物质在固定相上的吸附作用不同来

进行分配的。

①液-固色谱法的作用机制吸附剂：一些多孔的固体颗粒物质，其

表面常存在分散的吸附中心点。流动相中的溶质分子X(液相)被流

动相S带入色谱柱后，在随载液流动的过程中，发生如下交换反

应：X(液相)+nS(吸附)==X(吸附)+nS(液相)

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其作用机制是溶质分子X(液相)和溶剂分子S(液相)对吸附剂活性表

面的竞争吸附。

吸附反应的平衡常数K为：

K值较小：溶剂分子吸附力很强，被吸附的溶质分子很少，先流出色

谱柱。

K值较大：表示该组分分子的吸附能力较强，后流出色谱柱。

发生在吸附剂表面上的吸附-解吸平衡，就是液-固色谱分离的基础。

②液-固色谱法的吸附剂和流动相

常用的液-固色谱吸附剂：薄膜型硅胶、全多孔型硅胶、薄膜型

氧化铝、全多孔型氧化铝、分子筛、聚酰胺等。

一般规律：对于固定相而言，非极性分子与极性吸附剂(如硅

胶、氧化铜)之间的作用力很弱，分配比k较小，保留时间较短；但

极性分子与极性吸附剂之间的作用力很强，分配比k大，保留时间长。

对流动相的基本要求：试样要能够溶于流动相中流动相粘度较小流动

相不能影响试样的检测

常用的流动相：甲醇、乙腈、水等。

b.液-液色谱法（液-液分配色谱法）

将液体固定液涂渍在担体上作为固定相

①液-液色谱法的作用机制

溶质在两相间进行分配时，在固定液中溶解度较小的组分较难

进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较快；在固定液中溶解度较大

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的组分容易进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较慢，从而达到分

离的目的。液-液色谱