测定糖化酶活性的方法.ppt

关于测定糖化酶活性的方法糖化酶又称葡萄糖淀粉酶,糖化酶是一种习惯上的名称，学名为α-1,4-葡萄糖水解酶(α-1,4-Glucanglucohydrolace)。多应用于酒精、淀粉糖、味精、抗菌素、柠檬酸、啤酒等工业以及白酒、黄酒。糖化酶是由曲霉优良菌种（Aspergilusniger）经深层发酵提炼而成。糖化酶是食品工业中常用的一种酶。第2页,共16页，星期六，2024年，5月糖化酶是由一系列微生物分泌的具有外切酶活性的胞外酶。糖化酶的主要作用是从淀粉、糊精、糖原等碳链上的非还原性末端（整个碳链只有一个还原端，与之相对的都是非还原端）依次水解a-1,4糖苷键,切下一个个葡萄糖单元，并像β-淀粉酶一样,使水解下来的葡萄糖发生构型变化，形成β-D-葡萄糖。对于支链淀粉，当遇到分支点时，它也可以水解a-1,6糖苷键，由此将支链淀粉全部水解成葡萄糖。糖化酶也能微弱水解a-1,3连接的碳链，但水解a-1,4糖苷键的速度最快，它一般都能将淀粉百分之百地水解生成葡萄糖。第3页,共16页，星期六，2024年，5月酶活测定方法测定糖化酶的方法有次碘酸钠法、兰–爱农法（ＳＰ法）、Schoorl法（ＤＵ法）和对硝基苯酚葡萄糖法（ＮＰＧ法）、3,5-二硝基水杨酸(DNS)等方法。我们采用次碘酸钠法来测定糖化酶的活性。第4页,共16页，星期六，2024年，5月糖化酶以可溶性淀粉为底物在一定条件下（pH范围是4～6,温度范围是40～60℃）进行反应，生成的葡萄糖用次碘酸钠法定量测定。以单位时间内分解α–１，４糖苷键生成葡萄糖所需的酶量为酶的活力单位。次碘酸钠法：碘与NaOH作用能生成NaIO，而葡萄糖能定量地(1:1)被NaIO氧化在酸性条件下，未与C6H12O6作用的NaIO可转变成I2析出,因此只要用Na2S2O3标准溶液滴定析出的I2，便可计算出未参与反应的NaIO，由此推导出糖化酶催化所产生的C6H12O6的含量。第5页,共16页，星期六，2024年，5月具体步骤1.I2与NaOH作用:I2+2NaOH=NaIO+NaI+H2O2.C6H12O6与NaIO定量作用:C6H12O6+NaIO=C6H12O7+NaI第6页,共16页，星期六，2024年，5月3.C6H12O6反应完后,剩余的NaIO在碱性条件下发生歧化反应:3NaIO=NaIO3+2NaI4.歧化产物在酸性条件下进一步作用生成I2:NaIO3+5NaI+6H2SO4=3I2+6Na2SO4+3H2O5.析出的I2可用标准Na2S2O3溶液滴定之:I2+2Na2S2O3=Na2S4O6+2NaI第7页,共16页，星期六，2024年，5月注：在这一系列的反应中，1mol葡萄糖与1molNaIO作用，而1molI2产生1molNaIO，因此，1mol葡萄糖与1molI2相当。只要得出对照组和实验组所消耗的硫代硫酸钠体积，两者相减就可以得出与葡萄糖反应的那部分次碘酸钠的量，从而可以确定酶解生成的葡萄糖的量，从而计算出酶活。第8页,共16页，星期六，2024年，5月对照组实验组I2NaIONaIO另一部分歧化反应生成NaIO3NaIO一部分与葡萄糖反应I2I2NaIONaIO3I2完全歧化反应，无葡萄糖第9页,共16页，星期六，2024年，5月试剂与器材1.糖化酶试剂；2.微量滴定管、滴定台、试剂瓶、试管、三角瓶、pH计、电子天平；3.试剂2%可溶性淀粉溶液；pH4.6、0.1mol/L的醋酸缓冲液；0.1mol/L碘液；0.1mol/L氢氧化钠溶液；2mol/L硫酸溶液；0.1N硫代硫酸钠溶液；0.5%淀粉指示剂。第10页,共16页，星期六，2024年，5月操作步骤1.取7个带塞的试管（其中3个测今年批次的酶活、另外3个测去年批次的酶活、1个作空白对照），分别吸取2%可溶性淀粉液5ml，加入pH4.6醋酸缓冲液2.5ml，混匀后于40℃水浴中预热10min。2.加入酶液0.5ml（空白对照组以煮沸失活的酶液代替）于40℃，反应10min；反应结束时，立即于沸水浴加热5min使酶失活(此时应将试管的塞子打开）。第11页,共16页，星期六，2024年，5月3.取上述反应液5ml于三角瓶中，加入0.1N碘液5ml，缓慢加入0.1mol/LNaOH溶液5ml(注意:加碱速度不能过快,否则过量NaIO来不及氧化C6H12O6而歧