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细胞学分型法01原理：淋巴细胞增殖试验02应用：LD抗原（HLA-D、DP）03类型：双向混合淋巴细胞培养法单向混合淋巴细胞培养法04双向MLC方法原理双向MLC中的两种淋巴细胞既是刺激细胞又是反应细胞,彼此能发生相互作用。若彼此淋巴细胞均无形态学改变或细胞分裂增殖，说明两个个体间HLA型别相同。若彼此淋巴细胞均发生形态学改变或细胞分裂增殖，说明两个个体间HLA型别不同。04030102分离待检淋巴细胞，洗涤、计数，配成一定浓度。反应管加双方淋巴细胞，对照管分别加单方淋巴细胞。将细胞置CO2培养箱37℃培养5～6天。取沉淀物涂片、染色，高倍镜下计算转化率，或在培养终止前16～20h加3H-TdR，培养后将细胞收集于滤膜，液闪仪测定cpm，计算SI。双向MLC方法技术要点单向MLC方法原理单向MLC方法中的两种淋巴细胞有刺激细胞和反应细胞之分。首先将其中一种淋巴细胞用丝裂霉素处理或X线照射，使其丧失免疫反应能力，但HLA抗原不发生改变，因此被处理的细胞只作为刺激细胞，刺激细胞只能单向作用于反应细胞，它刺激另一种未处理的淋巴细胞，使其发生淋巴细胞转化和增殖。单向MLC方法类型纯合子分型细胞试验：阴性分型法预致敏淋巴细胞分型试验：阳性分型法HTC是只表达一种LD抗原的细胞，即同源染色体上编码LD抗原的MHC单倍型基因相同。这种细胞经丝裂霉素C处理或X线照射后，作为刺激细胞。试验时将已知型别的HTC与待检的淋巴细胞混合，进行单向MLC。若待检细胞不发生增殖反应（SI2），说明待检细胞与HTC的HLA型别相同。因根据阴性反应作为判定标准，故HTC试验又称为阴性分型法；HTC试验原理PLT试验原理预致敏淋巴细胞是一种仅对一种单倍型具有识别增殖能力，而处于静止状态的淋巴细胞。这种细胞遇到相应抗原刺激后，可迅速发生淋巴细胞转化和增殖。PLT试验是将此种细胞作为已知的分型细胞。正式试验时，将待检淋巴细胞处理作为刺激细胞，分别与一系列的预致敏淋巴细胞（反应细胞）进行单向MLC。如果待检细胞与预致敏淋巴细胞预先识别的抗原相同，预致敏淋巴细胞会迅速增殖。因预致敏淋巴细胞分型试验是用阳性反应作为判定标准，故PLT试验又称为阳性分型法。形态学方法以转化细胞百分率判断淋巴细胞反应程度，一般认为转化率小于5%为阴性；033H-TdR掺入试验以刺激指数（SI）判断淋巴细胞反应程度。04单向MLC方法的技术要点与双向MLC方法类似，不同点有：①需提前筛选纯合子分型细胞或制备预致敏淋巴细胞；01HTC试验中待检细胞不需处理，作为反应细胞，而PLT试验中待检细胞需进行处理，作为刺激细胞；02单向MLC方法的技术要点RFLP分析法01PCR-SSCP探针分型法02PCR-SSP分型法03PCR-SSCP04PCR指纹图谱技术05基因分型法限制性片段长度多态性分析法（RFLP）RFLP是最早建立的研究HLA多态性的基因分析技术。根据不同个体间的HLA相应碱基序列在不同部位存在多个不同酶切位点，通过一组限制性内切酶消化、识别、切割这些位点，产生数量和长度不一的DNA酶解片段，经电泳分离，与相应的cDNA探针进行杂交，即可分析限制性片段长度多态性，借以确定HLA的型别，这种HLA分型法称为DNA-RFLP。若对DNA片段进行体外扩增，然后再进行RFLP分析，则可大大提高RFLP的敏感度和特异性，这种引入DNA体外扩增技术的限制性片段长度多态性分析则称为PCR-RFLP分型法。PCR-SSOPPCR-SSOP分型法是将待检细胞HLA基因片段经PCR扩增后转移至NC膜或尼龙膜上，然后与放射性核素（32P）、生物素或地高辛等标记的SSCP探针进行杂交，若待检DNA与已知核苷酸序列的探针互补，则两者结合，即可分析出待检DNA序列，据此确定HLA的基因型别。PCR-SSP分型法PCR-SSP是根据HLA碱基序列的多态性和已知的DNA序列设计出一套针对每一等位基因的特异性引物，SSP只能和相应等位基因特异片段的碱基组列互补性结合。通过PCR技术将待检DNA扩增，产生相对应的特异性扩增产物，通过电泳分析确定HLA型别。PCR-SSCP单链DNA具有在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶电泳时，可形成一定的空间结构和构像的特点。即使长度相同的单链DNA其碱基顺序不同，甚至单个碱基不同，所形成的构像不同，电泳时泳动速度和迁移率也不同。PCR-SSCP是指目的DNA经PCR扩增、变性后进行SSCP分析，靶DNA中碱基序列的改变会出现泳动移位。因此，若供、受者的SSCP带型一致，则其HLA基因相匹配；若电泳带型不一致，则不匹配。PCR指纹图谱技术PCR反应过程中，