生物强化处理.ppt

PCR(Polymerasechainreaction)基本步骤：变性:采用高温使DNA变性，形成单链DNA;退火:降低温度，引物在与单链DNA互补的邻位结合，形成复合物.延伸:将温度调至DNA聚合酶的最适宜温度,该以dNTP为原料，根据碱基互补的原则，按照模板DNA序列组成，从引物的3’端开始逐一将dNTP聚合上去，合成一条新的DNA双链。第31页,共47页，星期六，2024年，5月PCRAmplifyingDNA第32页,共47页，星期六，2024年，5月PCR技术在环境检测中的应用主要有:应用PCR技术研究某一特定环境中微生物区系的组成，进而了解其菌群动态。应用PCR技术监测环境中特定种群（如致病菌、工程菌等）的动态。第33页,共47页，星期六，2024年，5月应用PCR技术检测样品中的特定微生物种群，其基本步骤包括：

从环境样品中提取核酸（DNA或RNA）；以提取的DNA或RNA样品为模板进行扩增；对PCR反应产物进行检测与分析。第34页,共47页，星期六，2024年，5月荧光原位杂交技术

（fluorescenseinsituhybridization,FISH）FISH是目前单个细胞水平上分析微生物群落结构的常用的分子生态学方法，是用标记过的DNA寡聚物去探测未损伤的微生物群落。第35页,共47页，星期六，2024年，5月原理微生物细胞在载玻片上脱水后，与带有荧光染料标记的寡核糖探针在一定温度下混合。具有与探针碱基对完全互补序列的RNA随即与探针发生杂交，从而使该菌体在荧光显微镜下发出荧光。第36页,共47页，星期六，2024年，5月细胞在测定过程中不被破坏，形状不改变，能够真实反映在自然微环境下的情况及分布

特异性强

能定量化

操作简单迅速。特点第37页,共47页，星期六，2024年，5月将染色体、细胞或组织固定；标记探针；将探针与固定材料上的靶序列（DNA或RNA）进行杂交；检测杂交的结果。FISH基本步骤：第38页,共47页，星期六，2024年，5月适用于所用菌种的EUB338;Alf968适用于Proteobacteria的α亚纲;BET42适用于Proteobacteria的β亚纲;GAM42适用于Proteobacteria的γ亚纲;CF319a适用于Cytophaga-Flavobacterium;ACA适用于Acinetobacter;Nso190适用于Proteobacteria的β亚纲的氨氧化菌;NEU23a适用于Nitrosomonas属的耐盐及嗜盐菌;NIT3可用于Nitrobacter;S-S-Mae-1414-a-A-18适用于M.erodenitrificans。一些常用的分子探针第39页,共47页，星期六，2024年，5月微生物群落解析应用1用FISH法解析UASB颗粒污泥的微生物群落结构。图中同时采用了两个探针进行FISH检测。探针EUB338能与绝大多数细菌杂交，发出绿色荧光；探针ARC915能与古细菌杂交，发出红色荧光。（A）低放大倍数；（B）高放大倍数。第40页,共47页，星期六，2024年，5月污泥膨胀中丝状菌的鉴别，比例和分布用FISH法检测某污水处理厂活性污泥中的丝状菌。(A）相差显微镜下的污泥絮体；（B）同一显微镜视野下同时用探针G2M（绿色）和G123（红色）进行FISH法检测。黄色表示同时与两个探针结合，为丝状菌Eikelboomtype021NII，红色则为丝状菌Thiothrix。应用2第41页,共47页，星期六，2024年，5月污泥中聚磷菌的鉴别应用3用FISH法和DAPI染色同时检测活性污泥中的聚磷菌。图中，蓝色作为DAPI染色的结果，代表在细胞体内聚集了大量聚合磷的细菌；而红色是FISH法的结果，代表与标记荧光染料的探针MP2发生杂交的菌体细胞，即M.phosphovorus。粉色是红色和蓝色的混合色，代表那些在细胞体内聚集了大量聚合磷的M.Phosphovorus细菌。第42页,共47页，星期六，2024年，5月生物标记技术(Biomarker)原理:生物标记，或标记基因，是一段DNA序列，将其引入微生物体内，使其具备一定的基因型或表现型，并能够在环境中检测出来.第43页,共47页，星期六，2024年，5月第44页,共47页，星期六，2024年，5月PCR-RFLP技术RFLP(restrictionfragmentlengthpolymorhpisms)即限制性片断长度多态性，是研究生物