要点精读-任务实施与操作记录.docx

人干扰素α2b发酵液的处理

任务实施

（一）生产前准备

1.确认与填写检查记录

确认是否有前批清场合格证副本，确认生产环境、卫生和设备器具是否符合要求。填写发酵液中菌体的处理产前检查记录。

2.领料与溶液配制

领取生产用试剂耗材物料并配制溶液，主要有：

（1）破菌缓冲溶液。pH为8.0的20mmol/LTris-HCl缓冲溶液，含2mmol/LMgSO4，0.05%溶菌酶，0.01%核酸酶。

（2）洗涤液Ⅰ（1L）。pH为7.5的2mol/LTris-HCl缓冲溶液10mL，EDTA-Na21.0g，尿素120g，TritonX-1008mL。

（3）洗涤液Ⅱ（1L）。pH为7.5的2mol/LTris-HCl缓冲溶液10mL。

（二）初步溶菌

1.量取菌体

取新制菌体或冻存菌体（将冻存待破碎菌体置于室温，待稍融化后使用），称取所需菌体量，将其置于破菌缓冲溶液。破菌缓冲液与菌体湿重的用量比为10∶1，即1g湿菌体用10mL的破菌缓冲液。

2.溶解菌体

取悬浮有菌体的破菌缓冲溶液，用电动搅拌器搅拌，至溶液中出现大量核酸时，按比例加入1mol/L硫酸镁至终浓度2mmol/L，加DNA酶至终浓度0.01%（W/V），继续搅拌16～24h。

（三）菌体的破碎

1.上料

将溶解菌体后料液定量置于高压均质机料斗内，每次装量3L左右，同时将冰块置于高压均质机装料斗内，冷却破菌液。

2.破碎菌体

打开高压均质机开关，拧紧二级阀，控制压力为（6±2）MPa，压力达到后开始拧紧一级阀，控制压力为（50±10）MPa，1min后打开放料阀开关，用不锈钢桶盛装从放料阀流出的破菌液，镜检是否有破碎不完全的完整菌体。如果有，则再次破碎，破菌液如果有粘稠感则需重复进行破碎。

3.收集包涵体

将高压匀浆后料液离心，离心条件：4℃，6000rpm，25min。离心结束后弃上清，收集沉淀，称量沉淀质量。

（四）洗涤

1.第一次洗涤

将与破菌缓冲溶液等体积的洗涤液Ⅰ加入沉淀中，用电动搅拌器搅拌至沉淀完全悬浮或溶解，搅拌时间为3h。

离心去除洗涤液Ⅰ：4℃，6000rpm，25min。弃去上清液，收集沉淀，称重。

2.第二次洗涤

将体积为破菌缓冲溶液体积1/2的洗涤液Ⅱ加入第1次洗涤后沉淀，用电动搅拌器搅拌至沉淀完全悬浮或溶解，搅拌时间为2.5h。

离心去除洗涤液Ⅱ：4℃，6000rpm，25min。弃去上清液，收集沉淀，即包涵体沉淀，称重。置于包涵体储存瓶中，标明品名、日期，置于－20℃的冰箱中，最长保存期为1年。

（五）清场

检查、整理各项记录。规范地存放生产用试剂，清洗器具，维护设备，处置废物和废液，清洁、消毒工作台和洁净室。最后，填写清场合格证。

人干扰素α2b发酵液的处理

操作记录

XX生物制药有限公司

人干扰素α2b发酵液处理操作记录

编号：R-PP-M-2-4

菌体批号

菌体湿重

g

无菌室温/湿度

℃/%

操作标准

破菌液配制、溶菌及菌体破碎

破菌液配制标准：

破菌缓冲溶液：菌体湿重

=10mL∶1g

pH8.0Tris-HCl：20mmol/L

MgSO4：2mmol/L

溶菌酶：0.05%

核酸酶：0.01%

菌体均质破碎条件：

二级阀压力（6±2）MPa

一级阀压力（50±10）MPa

溶液名称

试剂名称

用量

溶液体积

破

菌

溶

液

2mol/LTris-HCl

mL

mL

溶菌酶

g

1mol/LMgSO4

mL

核酸酶

g

溶菌

月日时分----月日时分

酶溶液体积

破碎次数

二级阀压力

一级阀压力

mL

次

MPa

MPa

离心转速

rpm

离心温度

℃

离心时间

min

离心后沉淀

g

日期

年月日

洗涤液I配制标准：

Tris-HCl：20mmol/L

EDTA-Na2：0.1%

TritonX-100：0.8%

尿素：12%

洗涤液II配制标准：

Tris-HCl：20mmol/L

依次用洗涤液A、B洗涤一遍后离心，条件均为：4℃，6000rpm，25min

洗涤液配制及洗涤

溶液名称

试剂名称

用量

溶液体积

洗涤液Ⅰ

2mol/LTris-HCl

mL

mL

EDTA-Na2

g

TritonX-100

mL

尿素

g

搅拌时间

月日时分----月日时分

离心后沉淀

G

日期

年月日

溶液名称

试剂名称

用量

溶液