生化技术蛋白质酶抗体标记.ppt

(2)二氯三嗪基氨基荧光素（DTAF)-抗体偶联(3)CyDye荧光染料-抗体偶联特点：①荧光染料可直接与二抗偶联，不需要反应底物②CyDyeULS标记的核苷酸和切口转移试剂盒，使用CyDyeTM荧光染料可以直接标记PCR产物采用荧光染料制备荧光素-抗体偶联的探针的方法(1)异硫氰酸盐衍生物-抗体偶联异硫氰酸荧光素（FTTC）、罗丹明异硫氰酸盐和四甲基罗丹明异硫氰酸（TRITC）第58页,共79页，星期六，2024年，5月3、生物素标记生物素标记的特点蛋白质(如酶和抗体)与小分子生物素偶联后，并不会改变其生物活性，反而可提高检测灵敏度第59页,共79页，星期六，2024年，5月(1)生物素标记抗体一般先将生物素制备成生物素琥珀酰亚胺酯（可直接购买），然后与IgG按一定比例反应标记第60页,共79页，星期六，2024年，5月(2)生物素标记蛋白质常用于标记蛋白质的生物素衍生物及标记原理①生物素-羟基琥珀酰亚胺（BNHS）在碱性条件下，可将生物素与蛋白质的α-NH2偶联；也可用于标记抗体、激素，或其他含Lys残基的多肽。此法制备的标记物稳定，标记效率高②生物素马来酰亚胺适用于含Lys残基或含-SH的蛋白质的标记马来酰亚胺通过提供间隔臂使生物素与蛋白质结合③生物素肼通过碳二亚胺（缩合剂）将生物素标记到蛋白质或肽的Asp或Glu的-COOH上第61页,共79页，星期六，2024年，5月生物素标记蛋白质的操作试剂：生物素酰氨基己酸N-羟基琥珀亚胺酯；间隔臂-氨基己酸操作：所有的试剂要在用时配制，生物素衍生物是溶在重蒸的DMF（二甲基甲酰胺）或DMSO（二甲亚砜）第62页,共79页，星期六，2024年，5月4、金标记原理借助金粒的电子密度特征，用其与抗体偶联后，可成功地置显微镜下观察胶体金颗粒分类及用途一般分为三种：5nm、l0nm和20nm5nm粒子容易渗透到细胞膜，使细胞间染色，适用于电子显微镜准确定位抗原l0nm粒子较大，可使细胞表面染色，适用于光学显微镜观察20nm粒子可用于免疫印迹和某些细胞和组织化学免疫染色第63页,共79页，星期六，2024年，5月简要操作(1)制备抗体以相应抗原作为配体，与CNBr活化的Sepharose-4B偶联制成的亲和吸附剂，装柱后用于分离纯化抗体(2)制备金粒①5nm金粒a．用100％二乙酯(diethylether)制备饱和磷(phosphorus)溶液(A)(Merck)，然后将棒状磷保存在水中并切成小段，迅速转移到10ml100％二乙酯中，密封2h以上b．离心收集固体部分，用1份溶液A与4份酯混合(溶液B)，同时制备1％HAuCl4(氯金酸盐)，用0.22μm滤膜过滤c．在装有冷凝迥流管的长颈烧瓶中，加3mlHAuCl4溶液、240mlH2O，混匀后，加5.4mlK2C03溶液调pH到9.0d．在搅拌下，加2ml溶液B到HAuCl4溶液中，于室温缓慢混合15mine．加热迥流，除去二乙酯，冷却到4℃，制备的胶体金溶液可使用两星期第64页,共79页，星期六，2024年，5月②12nm金粒在快速搅拌下，加10ml0.07％抗坏血酸溶液到一混合溶液(1mll％HAuCl4，1.5m10.2mol／LK2CO3和25mlH2O中，然后补加蒸馏水到100ml，除抗坏血酸钠溶液外，其余溶液都要经0.22μm滤膜过滤③17~20nm金粒制备4％HAuCl4储备液(Merck)，经0．22μm滤膜过滤后，取0.5ml4％HAuCl4溶液加到200ml水(终浓度0.01％)中，煮沸，然后加6ml1％柠檬酸钠溶液，加热迥流0.5h，冷却到4℃，该胶体金溶液使用时间同上④40nm金粒制备方法同上，仅仅是将1％柠檬酸钠溶液用量由6ml改为3ml第65页,共79页，星期六，2024年，5月(3)胶体金与抗体的连接①抗体将抗体溶液(1mg/ml)对2mmol／L硼酸缓冲液(pH9.0)透析，离心(100000g，1h，4℃，收集上清液立即与胶体金偶联(用不同稀释度抗体溶液与胶金偶联，以确定最佳浓度)②胶体金胶体金溶液经离心[3000g，15min(收集5~12nm粒子)；500g，15min(收集20~40nm粒子)]后，取5ml上清液[pH(已用0.2mol／LK2CO3调节)与偶联抗体pI相近，用抗血清作偶联物时，其pH≈9.0]与0.5ml抗体溶液迅速混合lmin，加100μl10％NaCl溶液，5min后，测定A280，以确定最