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手把手教你荧光定量PCR（一）
之前医学方小编教过大家如何在线利用NCBIprimerblast设计荧
光定量PCR引物，那么当我们有了引物，如何利用荧光定量PCR实验
来检测mRNA水平呢？今天小编先教给大家Real—timePCR最重要
的第一步，如何抽提高质量的RNA?
首先简单介绍一下实验中所用化学试剂耗材清单和作用，做到实
验时心中有数。
实验材料
Trizol
氯仿
异丙醇
无水乙醇
DEPC水(焦磷酸二乙酯)
Randomprimer
逆转录酶(AMV)及其buffer
RNaseinhibitor
新的没有用过的枪头
384孔板（透明）
DVD光盘（刻录拷贝数据）
八连PCR管
SYBRMasterMix
实验试剂作用
01
Trizol主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，则其主要作用是裂解细胞、
抑制RNAse活性和蛋白质变性
2
氯仿作用（1）变性蛋白，（2）抽取苯酚，促进水相和有机相分
离；（3）去除脂溶性物质如油脂。配合的异戊醇的作用是消泡。
三层：上清RNA苯酚氯仿DNA下层蛋白质
3
异丙醇作用：破坏核酸的氢键而促进其从水相中沉淀，配合使用
的醋酸铵等盐则中和核酸负电荷，加速核酸聚积沉淀。
4
75%乙醇的作用是去除异丙醇和其它盐分。
5
DEPC水(焦磷酸二乙酯)是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。
它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而
抑制酶的活性。
RNA抽提步骤
在所有RNA实验中，最关键的因素是得到全长的RNA。实验失
败的主要原因是RNA酶的污染。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，
如煮沸、高压灭菌等。RNA酶最主要的潜在污染源是研究人员的手。
因此操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。
设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。
低温下操作
第一步：抽提RNA
1
最大起始量107个细胞，六孔板每孔加入Trizol1ml，充分混匀
裂解细胞，吹打至无粘稠(室温静置15min充分裂解)。
2
混匀，加入267ul氯仿（按照氯仿与Trizol体积比
200ul/0.75ml），充分震荡混匀，冰上3min。
3
12000g，15min，4℃。
4
小心吸取上清水相至新的Ep管中（约500ul），用200ul枪头吸
出（千万不要吸入中间界面酚氯仿层）。
5
加入500ul(终浓度50%)异丙醇沉淀RNA，室温静置30min,或
充分沉降-20度过夜。
6
15000g，15min，4℃。
7
此时可看到管底白色沉淀，即为RNA，小心弃掉上清，加入
1ml75%乙醇（无水乙醇和DEPC水配置），洗涤沉淀RNA。
8
12000g，1min，4℃。
9
弃掉75%乙醇，重复洗一次后，空离十几秒，在超净台内将剩余
液体吸干(大枪头套小枪头)，并置于超净台内风干。
10
根据RNA量,加入15-30ulDEPC水，吹打将RNA沉淀悬浮混匀。
11
3
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