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外泌体的鉴定宝典

外泌体参与神经疾病和癌症等很多种疾病的病理过程，同时在正

常的生理过程中也发挥着介导细胞间通讯的重要功能。细胞外囊泡在

临床医学中也有十分光明的应用前景，由于它们含有丰富的生物标志

物，可用于监测疾病进展，治疗反应等，同时由于外泌体具有携带递

送生物分子的功能，具有成为临床药物递送载体的潜力。外泌体的功

能研究第一步，即进行外泌体的鉴定。

鉴定外泌体首先需要通过WB来鉴定外泌体的标志蛋白是否存在

于样品中，通过电子显微镜来观察样品中细胞外囊泡的形态特征以及

直径，对其进行区分鉴定。

1WB验证：检测外泌体标志蛋白的表达情况

外泌体形成于早期胞内体，在内吞体转运复合体（ESCRT）及一

些相关蛋白的调控下，早期胞内体发生内出芽形成多个腔内小囊泡，

构成多胞体（MVB），MVB最后在GTPase家族中的RAB酶调解下

与细胞膜融合向外界释放囊泡。

wode

外泌体膜上富含参与外泌体运输的四跨膜蛋白家族（CD63、

CD81和CD9)）、热休克蛋白家族（(HSP60、HSP70、HSPA5、

CCT2和HSP90)以及一些细胞特异性的蛋白包括A33（结肠上皮细胞

来源）、MHC-II(抗原提呈细胞来源)、CD86(抗原提呈细胞来源)以及

乳凝集素（不成熟的树突状细胞）。其中CD63、CD9、CD81以及

TSG101、HSP70、ALIX等，是最常用到的细胞外囊泡标志物。

这些标志物蛋白其实主要是涉及到了囊泡的形成和分泌过程，他

们产生于细胞中，定位于胞内的膜结构附近，如四旋蛋白（CD9，

CD63和CD81），直接参与了细胞外囊泡内容物的分选；TSG101是

ESCRT复合体相关的蛋白，而ESCRT复合体是膜形成和断裂的驱动器。

ALIX直接涉及到了膜泡在形成过程中切割脱离质膜形成独立膜结构的

过程。

可选实验操作步骤：

（1）超离后获得外泌体，加入PBS重悬或者加入蛋白裂解液（若

外泌体量小，加入裂解液后可省略离心取上清步骤）。

（2）对外泌体以及对照细胞裂解样品进行蛋白BSA定量。

（3）向每个管中加入5xSDS样品缓冲液，稀释至1X。

（4）95℃加热5分钟，使蛋白变性。

（5）将样品5-10ug样品进行上样，选用10％或12％的凝胶进

行电泳，检测标志蛋白。

在进行WB验证时，最好也选择一些外泌体没有而细胞总蛋白才

有的标志蛋白，如GRP94，EEA1，GM130，PMP70等。

2电镜：分析外泌体的大小/形态等。

若更确切的去鉴定外泌体，则需要通过外泌体免疫胶体金电镜来

观察蛋白质在外泌体中的位置。

现代先进的扫描电镜的分辨率已经达到1nm左右，足够用来进行

外泌体尺寸的测量，在外泌体研究中，能够直接观察到样品中外泌体

的形态。

可选实验操作步骤：

（1）超离后获得外泌体，加入2％戊二醛，4℃固定。

（2）磷酸缓冲溶液漂洗4次，每次15分钟。

（3）1％四氧化锇将样品后固定2小时

（4）ddH2O漂洗两次，每次10分钟。

（5）2%碳酸铀水溶液染色2小时。

（6）脱水：50％乙醇溶液-70％乙醇溶液-90％乙醇溶液-100％

乙醇溶液-100％丙酮1-100％丙酮2，4℃孵育15分钟。

（7）渗透：并加入1：1丙酮：包埋剂，室温孵育2小时。然后

加入纯包埋剂，室温孵育过夜。

（8）使用包埋模具进行包埋。

（9）聚合：37℃恒温箱12小时-45℃恒温箱12小时-60℃下烘

烤48小时。