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叶酸的测定方法

微生物法

1.原理

叶酸是酪乳酸杆菌（Lactobacilluscasei,L.C,ATCC7469）生长所必需的营养素。在一定条

件下，L.C的生长繁殖与培养基中叶酸含量呈正比关系，细菌增殖的量以光密度值计，通过

与标准曲线相比较，计算出样品中叶酸的含量。

2.适用范围

参考《MethodsofVitaminAssay》，第4版。本方法适用于各类食物中叶酸的测定。检测限

为0.1ng。

3.仪器与设备

（1）恒温培养箱

（2）离心机

（3）高压消毒锅

（4）震荡器

（5）接种针和接种环

（6）分光光度计

4.试剂

除特殊说明外，本实验中所有试剂均为分析纯，水为蒸馏水。

（1）菌种：酪乳酸杆菌（Lactobacilluscasei,L.C,ATCC7469）

（2）磷酸缓冲液(0.05mol/L,pH6.8):称取4.35gNa3PO4·12H2O,10.39gNa2HPO4·7H2O溶解

于800ml水中。临用前用约5g抗坏血酸调节pH至6.8。（注：叶酸对光、热敏感，易被氧

化破坏，抗坏血酸有助于保护叶酸被氧化。）

（3）鸡胰酶溶液：称取100mg干燥的鸡胰酶（Difco公司）（注：含有叶酸轭合酶，用于

水解叶酸多谷氨酸盐），加入20ml磷酸缓冲液制成匀浆，3000rpm离心10min,取上清液备

用。临用前现配。

（4）蛋白酶-淀粉酶溶液：分别称取200mg蛋白酶（Sigma公司）和淀粉酶（Sigma公司），

加入20ml磷酸缓冲液制成匀浆，离心3000rpm10min,取上清液备用。临用前配制。

（5）2+8乙醇溶液：量取20ml无水乙醇溶液，加入80ml水混匀。

（6）01mol/LNaOH:称取0.4g氢氧化钠，加2+8乙醇溶液溶解并稀释至1L。

（7）10mol/LNaOH。称取400g氢氧化钠，加水溶解并稀释至1L。

（8）叶酸标准储备液（200mg/ml）：准确称取200mg叶酸标准品（Sigma公司，纯度大于

98%），用0.01mol/LNaOH溶解并定容至1L。储存于棕色瓶中。

（9）叶酸标准中间液（200ng/ml）：准确吸取1.0ml叶酸标准储备液，用0.01mol/LNaOH溶

解并定容至1L。储存于棕色瓶中。待标定。

标定：准确吸取1ml叶酸标准中间液，用0.1mol/LNaOH定容至10ml。以0.1mol/LNaOH

调零点，比色杯厚度1cm，波长256nm，测定3次紫外吸光度值，取平均值，按下式计算标

准中间液浓度。

公式(略)

式中：

X1--叶酸标准中间液浓度，ng/ml；

A--标准中间液平均紫外吸光度值；

E--摩尔消光系数24,500；

M--叶酸分子量441.42；

10--测定紫外吸光度值时的稀释倍数；

106--由g/L换算成ng/ml的换算系数。

（10）叶酸标准工作液（0.2ng/ml）:准确吸取1.0ml叶酸标准中间液，用磷酸缓冲液稀释定

容至1L。

（11）2.4mol/LHCl：量取20ml浓盐酸，加水稀释至100ml。

（12）酶解酪蛋白溶液：将8g碳酸氢钠溶解于1L水中，加入60g去维生素酪蛋白（Sigma公

司），用10mol/LNaOH调节pH至8.0（调pH时应小心，不要过碱后再加酸反复调节，避

免酪蛋白结块）。加入300mg胰酶，搅拌20min，使胰酶混匀充分。再加入2.5ml甲苯，置

37℃恒温箱酶解48～72h（此步骤是将酪蛋白酶解为L.C可以利用的小分子肽。酶解时间不

易超过72h，如时间过长，配成的培养基不利于细菌生长）。将酪蛋白液从恒温箱中取出，

121℃高压30min以终止反应并去除甲苯。冷却，加10g硅藻土搅拌，用垫有滤纸的布氏漏

斗过滤。向滤液中加入约60ml冰乙酸调节pH至3.7。称取活性炭12g，加入滤液中搅拌10min，

用布氏漏斗过滤，重复三次。每次过滤时，布氏漏斗内加有10g硅藻土协助过滤。最后滤液

用水稀释至1200ml，4℃冰箱保存1年（活性碳可吸附酪蛋白中的叶酸以减少试剂空白，同

时也可吸附肽及氨基酸，应注意控制搅拌时间）。取10ml酶解后的酪蛋白溶液加入已称重

的蒸发皿