6.5酶联免疫吸附试验(ELISA).ppt

ELISA-酶标仪ELISA-试剂盒ELISA-试剂盒ELISA-试剂盒夹心法（测抗原、抗体）间接法（测抗体）竞争法（测抗原）ABS-ELISA法（测抗原、抗体）二、ELISA分类2.1夹心法双抗体夹心法测抗原双抗原夹心法测抗体2.1.1双抗体夹心法测抗原此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBsAg的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。2.1.2双抗原夹心法测抗体模板来自于*在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）②酶标记的抗原或抗体（标记物）③酶作用的底物（显色剂）测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结合后，再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。其所生成的颜色深浅与欲测的抗原（抗体）含量成正比。这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，也可以用分光光度计（酶标仪）加以测定。*由于ABS-ELISA较普通ELISA多用了两种试剂，增加了操作步骤，在临床检验中ABS-ELISA应用不多。*免疫标记技术酶联免疫吸附试验（ELISA）抗体抗体（Antibody，Ab）是B细胞产生的一种蛋白质，主要存在于血清等体液中，能与相应抗原特异性地结合，具有免疫功能。抗体具有两个特点：高度的特异性和庞大的多样性。背景知识抗体的基本结构抗体天然Ig分子含有四条异源性多肽链，其中，分子量较大的两条链称为重链(heavychain,H)，而分子量较小的两条链称为轻链(Lightchain,L)。同一Ig分子中的两条H链和两条L链的氨基酸组成完全相同。抗体的制备流程一个抗原上可以有好几个不同的抗原决定簇，因而使机体产生好几种不同的抗体，最终产生出抗体是浆细胞。只针对一个抗原决定簇起作用的B细胞群或浆细胞群就是一个纯系，纯系的英文为Clone，音译就是克隆。由一种B细胞群或浆细胞克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。单克隆抗体能目标明确地与单一的特异抗原决定簇结合，就象导弹精确地命中目标一样。另一方面，即使是同一种抗原刺激机体，也存在多种抗原决定簇，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体。抗体的克隆性抗原抗原（Antigen）：抗原就是能引起免疫反应的物质，它主要是大分子的蛋白质以及病原体，也可以是其它小分子，如多肽、糖、脂肪分子等。抗原刺激机体的免疫系统，引起免疫反应。抗原抗原具有两种性能：?免疫原性(immunogenicity):指抗原分子具有诱导机体产生免疫应答的特性。?反应原性(reactogenicity):指抗原分子与抗体或效应T细胞等免疫应答产物发生特异性反应的特性。抗原决定簇抗原决定簇（Antigenicdeterminant）：又称为表位（epitope），指抗原表面决定该抗原特异性的一个特定的分子结构，它可以是氨基酸基团或者单糖残基，只能被一个单独的抗体或T细胞受体结合。抗原决定簇抗原决定簇决定着抗原的特异性，即决定着抗原与抗体发生特异结合的能力。抗原决定簇多位于蛋白质的表面，一个蛋白质大分子常有许多抗原决定簇。抗原决定簇依赖于氨基酸序列和空间构象两种因素，又分为线性决定簇(Lineardeterminants)、构象决定簇(conformationaldeterminants)和新生抗原决定簇(Neoantigenicdeterminant)。免疫标记技术原理：利用抗原抗体反应的原理，于抗原或抗体上加载各种标志物，抗原抗体反应中加入标志物示踪，利用标志物的可测量性来达到快速、敏感地检测各种体内微量生物活性物质。特点：特异性、转移性、高效性。发展1941年Coons建立荧光抗体技术1959年Yalow和Berson创建放射免疫分析1971年Engvall和Perlaman以及Weeman和Schuur用酶代替放射性核素制备了酶标记物，创立了酶免疫分析技术。ELISA的基础一*ELISA影响因素三实验常见问题四ELISA分类二酶联免疫吸附试验（ELISA）1.1ELISA的概念