碱裂法1完整版本.docxVIP

碱裂解法质粒抽提

溶液I：50mM葡萄糖/悬浮大肠杆菌

25mMTris-Cl/抑制DNase的活性，和抑制微生物生长

10mMEDTA/螯合二价金属离子

pH8.0；

溶液II：0.2MNaOH和1%SDS，等体积混合/破碎细胞

溶液III：3M醋酸钾，2M醋酸/中和

步骤：

1， 收集菌液。离心，12,000rpm×2mim；

2， 再悬浮。溶液I，200ul悬浮。菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。

3， 裂解。溶液II，现配，200ul。上下颠倒混匀，切勿剧烈震荡；

第一， 时间不能过长，冰上2min。防止在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；

第二，必须温柔混合，防止基因组DNA断裂。

4， 中和。溶液III，200ul。冰上5min；

5， 离心12,000rpm×10mim，取上清，氯仿抽提；

6， 加入1:1体积的异丙醇，离心后70%乙醇洗一次，晾干,30-50ulRnaseA(0.5%)无菌水溶解。

7， 电泳：三条带，

超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。如果你不小心在溶液II加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是20-100kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。