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CHO细胞克隆株放大培养与筛选2

方案三细胞的悬浮驯化

CHO-K1细胞的悬浮驯化及无血清培养

1.取对数生长期的CHO-K1贴壁细胞，采用逐步降血清法将含10%FBS的

F12培养基逐步替换为8%、5%、3%、2%、1%、0.5%FBS的F12培养基进

行适应培养，每个血清浓度传代培养15~20次，使细胞在各血清浓度培养基

里适应生长。

2.取适应0.5%FBS的F12低血清培养基培养条件的CHO-K1贴壁细胞，以

5

5×10cells/mL的密度接种到125mL的三角细胞摇瓶中，逐步加入含有50%、

70%、80%、90%、100%SigmaEx-CELLCDCHO细胞培养基，37℃，5%

CO，100rpm条件下进行培养液的逐步替代培养

2

方案四三阶段悬浮驯化

CHO-K1悬浮驯化培养基及驯化方法_肖志华

1.将CHO-K1细胞在含有10％FBS的F-12K培养基中培养，当细胞汇合度到

5

70～80％时，加胰酶消化，缓慢吹打混匀，以0.4×10cells/ml的密度接种至

10ml含10％FBS的F-12K培养基中传代，并观察细胞状态。此阶段培养条

件为37℃，体积分数为8％CO培养箱，静止培养。当细胞汇合度到70～

2

80％，加胰酶消化并以同样的密度接种至10ml含5％FBS的F-12K培养基

中。培养两代后，用同样的方法将血清逐步降低至2.5％，培养3代，随着血

清含量降低，起初细胞生长变慢，待细胞轮廓清晰、伸展状态良好之后，开

始下一步降血清处理，通常细胞适应2-3代后，在血清降至2.5％之前，细胞

都可以很快地扩增。（阶段Ⅰ）

2.条件培养基(ConditionMedium，CM)制备：细胞在含有2.5％FBS的F-12K

培养基2-3天后，收集培养上清200g离心5分钟后，用0.22μm的无菌滤膜

过滤后待用。

3.细胞在含有2.5％FBS的F-12K培养基中培养3代，细胞汇合度到70～80％

时，用PBS洗两遍，加入胰酶消化，消化30秒后弃去胰酶，待细胞消化变

圆以后，加入完全培养基（含血清）终止消化。轻轻吹打细胞，使细胞从壁

上脱落。缓慢吹打混匀，室温下，200g水平离心5mins，收集细胞(上清可

保留用于制备CM)。将细胞接种到含有2.5％FBS的培养基(含重量比例为

48.5％CDCHOMedium，1％IGF-1，0.5％的泊洛沙姆188，50％的条件培

养基和6mML-glutamine)的125ml摇瓶(ShakeFlask,SF)中，接种密度为10

×105cells/ml，培养体积为30ml。将摇瓶置于37℃，8％CO，120转/分钟

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(rpm)的细胞培养摇床中进行培养。

4.每天取样计数，观察活细胞数(VCD)和细胞活率(Viability)。如果出现细胞密

度低于5×105cells/ml或者细胞活率低于50％，应将原培养条件下贴壁细胞

消化后加入细胞至活细胞数至10×105cells/ml，一起培养。活细胞数增加至

55

10×10cells/ml以上，则以8×10cells/ml接种含有2.5％FBS的培养基(含重

量比例为48.5％CDCHOMedium，1％IGF-1，0.5％的洛沙姆188，50％的

条件培养基和