奶及奶制品中α-乳白蛋白的测定 高效液相色谱法.docxVIP

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奶及奶制品中α-乳白蛋白的测定高效液相色谱法1范围

本文件描述了奶及奶制品中α-乳白蛋白的高效液相色谱测定方法。

本文件适用于生乳和巴氏杀菌乳。

本文件的定量限为25.0mg/kg。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文

件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4原理

试样溶液调节pH至4.6，使酪蛋白和变性的乳清蛋白沉淀，而未变性的α-乳白蛋白仍保留在溶液中，对紫外光有吸收作用，在液相色谱仪经反相蛋白质分离柱分离，紫外检测

器检测，以保留时间定性，外标法定量。

5试剂或材料

除非另有说明，所有试剂均为分析纯和符合GB/T6682规定的一级水。

5.1乙酸。

5.2三氟乙酸溶液：量取1mL三氟乙酸（色谱纯），用水定容至1L，混匀。

5.3三氟乙酸乙腈溶液：量取1mL三氟乙酸（色谱纯），用乙腈（色谱纯）定容至1L，混匀。

5.4α-乳白蛋白对照品：CAS：9051-29-0，纯度≥85.0%。

5.5α-乳白蛋白标准储备溶液（10mg/mL）：将α-乳白蛋白对照品按对照品证书提供的纯度换算后称量（精确到0.01g），用水定容至10mL。冷冻保存，有效期3个月。

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5.6α-乳白蛋白标准中间溶液（200mg/L）：准确移取α-乳白蛋白标准储备溶液（5.5）200μL，用水定容至10mL。现用现配。

5.7α-乳白蛋白标准系列工作溶液：准确移取一定量的标准中间溶液（5.6），用水稀释定容，配制成α-乳白蛋白浓度分别为0mg/L、40.0mg/L、80.0mg/L、120.0mg/L、160.0mg/L和200.0mg/L的标准工作溶液，现用现配。

5.8微孔滤膜：水系，0.22μm。

6仪器设备

6.1高效液相色谱仪：配紫外检测器或二极管阵列检测器。

6.2天平：感量0.01g、0.01mg。

6.3容量瓶：10mL、25mL。

6.4旋涡混合器。

6.5离心机：转速不低于10000r/min。

6.6pH计：精度为0.01。

7样品

取有代表性样品约200g，混匀，装入洁净容器作为试样，密封并做好标识，冷藏保存。

8试验步骤

8.1样品提取

称取试样5g（精确到0.01g），加适量水混匀，加入乙酸调节pH为4.60±0.05，加水

定容至25.0mL，混匀静置1h。离心15min。吸取上清液，过微孔滤膜后待测。

8.2测定步骤

8.2.1液相色谱参考条件

——色谱柱：XbridgeProteinBEHC4柱（柱长250mm，柱内径4.6mm，填料粒径3.5μm），

或相当者。

——流动相：A：三氟乙酸溶液（5.2），B：三氟乙酸乙腈溶液（5.3）。

——检测波长：210nm。

——梯度洗脱条件见表1。

3

——流速：1.5mL/min。

——柱温：60oC。

——进样量：30μL。

表1流动相梯度洗脱条件

时间/（min）

A/（%）

B/（%）

0

95

5

6.5

62

38

10

62

38

22

59

41

22.5

40

60

27.5

40

60

28

95

5

35

95

5

8.2.2测定

取标准系列溶液（5.7）和试样溶液（7）上机测定。以α-乳白蛋白的峰面积为纵坐标，以标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线回归方程。α-乳白蛋白标准溶液的

液相色谱图参见附录A。

9试验数据处理

试样中α-乳白蛋白的质量分数X计，数值以毫克每千克(mg/kg)表示，按下列公式计算：

X=c根V根1000根f

m根1000

式中：

c——被测组分曲线计算浓度，单位为毫克每升(mg/L)；

V——样液最终定容体积，单位为毫升(mL)；

m——试样质量，单位为克(g)；

f——稀释倍数

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1000——换算系数

计算结果保留到小数点后一位。

10精密度

在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于算术平均值的10%。

附录A

（资料性）

α-乳白蛋白液相色谱图