肿瘤细胞培养技术课件.ppt

肿瘤细胞培养技术免疫方法脾内免疫优点：时间短，使用抗原量少。可溶性抗原：2~10?g细胞抗原：1?105缺点：效果差于常规免疫，尤其无基础免疫的脾内免疫。肿瘤细胞培养技术免疫方法脾内免疫方法：BALB/C小鼠乙醚麻醉，右卧位，消毒，无菌操作剪开皮肤，透过腹膜，用4号针头注射器注入脾脏，尽量刺深，勿刺透，纵轴方向，边退边注射或多点注射。注意事项：抗原体积?0.2ml，脾内逐步注射后，针头拔出口时要停留片刻，缝合切口或用医用黏合剂涂抹切口。肿瘤细胞培养技术免疫方法3.弱免疫原免疫方案；0天：基础免疫30天：基础免疫45天：基础免疫60天：基础免疫75天：基础免疫6个月内，至鼠血清测出抗体产生。静脉或脾内追加免疫后72~96h细胞融合。肿瘤细胞培养技术免疫方法4.体外免疫：分离小鼠脾细胞，置10%~20%FCSRPMI1640培基，加适量滋养细胞与抗原（可溶性抗原0.5~5?g/ml；细胞性抗原105~106/ml），37℃，5%CO2培养3天，再分离淋巴细胞与骨髓瘤细胞，融合。肿瘤细胞培养技术单克隆抗体制备一.滋养细胞制备：1.机制：不明，通常认为这类细胞释放一种或几种生长因子，提供必要生长条件。2.小鼠腹腔巨噬细胞制备滋养细胞⑴正常无感染BALB/C小鼠，处死。⑵75%乙醇浸泡5~10min，肿瘤细胞培养技术单克隆抗体制备⑶撕开腹部皮肤，充分暴露腹腔，提起腹膜，剪开，吸管注入5ml无血清培基，小心提动或轻揉腹膜，吸出培基。⑷无血清培基洗2次，细胞浓度2×105/ml,0.1ml/孔/96孔，相当于2×104。通常获2×106~5×106只。肿瘤细胞培养技术单克隆抗体制备二.骨髓瘤细胞准备：Sp2/0,NS-1等1.复苏，20%FCSRPMI-1640培基为好。2.培养、传代，取对数生长期细胞（1×105~5×105/ml），按1：5~1：10稀释传代，2、3天扩大培养，选生长状态、形态好对数生长期细胞融合用。3.RPMI-1640培基洗3次（1000r/min×5min)肿瘤细胞培养技术单克隆抗体制备注意事项：1.骨髓瘤细胞的细胞活数应在〉95%，2.无各种污染，3.骨髓瘤细胞质量保证、生长密度合适。肿瘤细胞培养技术单克隆抗体制备三.免疫脾细胞悬液制备：1.免疫BALB/C鼠，放眼血致死（收集眼血制成血清）。2.浸泡于75%乙醇5~15分，入超净台，打开腹腔（逐次换器械），取脾。3.剪碎脾脏，注射器内芯研磨过100目钢筛，平皿预先2~3mlRPMI-1640，移入圆底试管，补加适量培基，，静置3~5分，取上2/3悬液移入50ml离心管，上述反复2~3次。肿瘤细胞培养技术单克隆抗体制备三.免疫脾细胞悬液制备：5.上述培基洗细胞2次（1000r/min×10min），6.不完全培基10ml重悬液，台盼蓝计数活脾细胞数，1×108~2.5×108/只。肿瘤细胞培养技术单克隆抗体制备四.50%PEG的准备：融合前，称PEG（mw=4000)2g，置小瓶内，低压消毒（8磅），15min,取出立即边加边摇加入2ml完全培基，（内含0.3%ml二甲基亚枫，以提高融合率），至完全混合，4℃保存。用前37℃预热。要求PEG现配，防止PH变碱。肿瘤细胞培养技术单克隆抗体制备五.细胞融合：1.将准备好的骨髓瘤细胞与脾细胞混合于50ml离心管内（脾细胞1×108，骨髓瘤细胞1×107）。用SP2/0时，脾细胞：骨髓瘤细胞以10：1为好；用NS-1，脾细胞：骨髓瘤细胞以5：1为好。肿瘤细胞培养技术单克隆抗体制备2.RPMI-1640培基洗2次（1500r/min/8min）；3.倾倒上清，吸尽残留液，轻弹管底，使细胞疏松，离心管移至超净台预先放置的37℃水浴。