分子实验学报告-重组质粒的酶切鉴定及PCR实验.pdfVIP

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第三次分子生物学实验报告

重组质粒的酶切鉴定及PCR实验

一、实验目的

1、通过酶切鉴定重组质粒的插入片段的大小；

2、学习并掌握PCR技术的原理和基本操作。

二、实验原理

1、重组质粒酶切鉴定

将含有外源DNA的转化子的E.coliDH5α菌株进行培养，并用试剂盒提取其质粒DNA，

将所提取的DNA用切pUC19质粒的同一种限制性内切酶进行切割以验证所插入的外源

DNA的大小。

2、PCR原理

PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶链式反应是1986年由KallisMullis发现。这

项技术已广泛地应用于分子生物学各个领域，它不仅可用于基因分离克隆和核酸序列分析，

还可用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析等方面。本次实

验旨在通过学习和掌握PCR反应的基本原理和实验技术，以验证重组质粒插入片段大小。

（1）聚合酶链式反应原理

CR是一种利用两种与相反链杂交并附着于靶DNA两侧的寡核苷酸引物，经酶促合成

特异的DNA片段的体外方法。反应过程由高温变性，低温退火和适温延伸等几步反应组成

一个循环，然后反复进行，使目的的DNA得以迅速扩增。置待扩增DNA于高温下解链成

为单链DNA模板，人工合成的两个寡核苷酸引物在低温条件下分别与目的片段两侧的两条

链互补结合，DNA聚合酶在72℃将单核苷酸从引物3端开始掺入，沿模板5—3方向延伸，

合成DNA新链。由于每一循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，所以PCR产

物以指数方式增加，经25—30次周期之后，理论上可增加109倍，实际上可增加107倍。

PCR技术具有操作简便、省时、灵敏度高特异性强和对原始材料质量要求低等优点，

但由于所用的TaqDNA聚合酶缺乏5—3核酶外切酶活性，不能纠正反应中发生的错误核苷

酸掺入，估计每9000个核苷酸会导致一个掺入错误，但是错误掺入的碱基有终止链延伸的

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作用倾向，使得错误不会扩大。

（2）PCR的反应动力学

PCR技术类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸

引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或

经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左

右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应

原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的

半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链