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臣心一片磁针石,不指南方不肯休。——文天祥
第九章免疫学活性测定
Dotblot原理:
原理:抗原抗体和受体配体结合可以被利用作蛋白质简单快速的定量
分析。被吸附在96孔板底部的抗原抗体或者受体配体可以被标记的
抗体识别并进行定量记数形成定量分析方法的基础。由于细胞培养需
要不断监测,工作量很大。因此快速简洁的定量分析是检测细胞表达
水平监测的重要手段。主要监测方法包括Dotblot和ELISA。
Dotblot
Dotblot是最快速简捷的方法之一,简述如下:在超净台内,使
用无菌多孔加样器将96孔板内的细胞克隆培养液以5µL上样量,成
排点于硝酸纤维素膜上并风干,记录好样品顺序(可在膜的正面边缘
处标记正面及名称,也可通过在膜的右下角剪去一角作为标记,识别
膜的正反面及方向)。取上面风干好的硝酸纤维素膜,用配制好的封
闭液(脱脂奶粉或白蛋白溶液)室温震荡孵育至少一小时。此步骤的
目的是封闭硝酸纤维素膜上的非特异性蛋白结合位点,以避免下一步
加入的抗体与膜发生非特异性结合。将封闭好的硝酸纤维素膜浸泡在
第一抗体中,室温震荡孵育1小时,然后用TTBS溶液淋洗膜2遍后,
将膜浸泡到TTBS溶液中,室温震荡洗涤3次,每次5分钟。将洗涤
后的硝酸纤维膜浸泡在含有酶标第二抗体溶液中,室温震荡孵育1小
时,然后用TTBS溶液淋洗膜2遍后,将膜浸泡到TBST溶液中,室
温震荡洗涤3次,每次5分钟。最后,将膜浸于荧光显色剂(新鲜刚
臣心一片磁针石,不指南方不肯休。——文天祥
刚混合的等量A和B液)。1-2分钟后将浸泡过的膜,抖去多余显色
剂,夹入保鲜膜(保鲜膜应薄而透明,以免阻挡曝光效果)中,同时
观察显色情况,确定大致曝光时间(一般情况下,如果样品亮度肉眼
可见且较强,那么初次曝光时间应较短,一般选3-5秒;如果样品亮
度肉眼不可见,则初次曝光时间应略长一些,一般选择1分钟),曝
光完毕,经显影,定影后,用清水冲洗X光胶片,根据胶片上结果
情况,再将膜放入曝光暗盒中进行二次曝光及显影、定影反应。溶液
配制及整个操作过程请斑点杂交操作流程图。Dotblot需要TTBS溶
解的倍比稀释后的标准品做对照方能进行半定量。同时样品倍比稀释
也是半定量所必需。
臣心一片磁针石,不指南方不肯休。——文天祥
附1:Dot-Blot操作流程图
以
下
均
用
微
振
摇
床
混
和
臣心一片磁针石,不指南方不肯休。——文天祥
一、试剂
1、抗待检样品抗体:
第一抗体为纯化鼠抗人IgGFc单抗;
第二抗体为HRP-兔抗小鼠IgG二抗。
2、封闭液(5%脱脂奶粉)
3、底物荧光显色剂A、B
4、TTBS(10×)缓冲液:取三羟甲基氨基甲烷(Tris)60.5g,NaCl45g,吐温
-805.5ml,加适量超纯水溶解,用浓盐酸(~32ml)调PH7.5,补加超纯水
至500ml。置于棕色瓶中,4℃保存,有效期6个月。用前10倍稀释为1
×TTBS缓冲液。
二、操作
1、取硝
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