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D-丙氨酸缺失时耻垢分枝杆菌中丙氨酸消旋酶对生长必需.pdfVIP

D-丙氨酸缺失时耻垢分枝杆菌中丙氨酸消旋酶对生长必需.pdf

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以铜为镜,可以正衣冠;以古为镜,可以知兴替;以人为镜,可以明得失。——《旧唐书·魏征列传》

D-丙氨酸缺失时耻垢分枝杆菌中丙氨酸消旋酶对生长必需

摘要:丙氨酸消旋酶,由alr基因编码,是在肽聚糖生物合成中合成D-丙氨酸的一种重要

酶。发现耻垢分枝杆菌中的alr基因的缺失突变株需要D-丙氨酸才能在培养基中生长。这

表明,丙氨酸消旋酶是耻垢分枝杆菌细胞壁的生物合成中D-丙氨酸的唯一来源,并证实丙

氨酸消旋酶可以作为一个靶基因来开发抗分枝杆菌药物。

结核病是世界传染病死亡率领先的疾病。每年近200万人死于结核病,三分之一的世

界人口潜伏感染结核杆菌(6,35)。由于其对全球健康的重要性,研究者对抗结核药物的

识别和发展有极大的兴趣。一个具有显著历史价值的目标就是丙氨酸消旋酶(5,14,22)。

丙氨酸消旋酶是维生素B6的磷酸盐同型二聚体酶,其催化L-丙氨酸向D-丙氨酸的转化,

是细菌细胞壁生物合成肽聚糖层中一个关键步骤。丙氨酸消旋酶通常不存在于真核生物中

但原核生物中普遍存在,这使得这种酶成为新型抗菌药物开发很吸引力的目标。

虽然D-丙氨酸对细菌细胞壁的形成至关重要,但确定是哪个基因对D-丙氨酸生物合成

途径重要是复杂的。细菌含有一个或两个丙氨酸消旋酶的基因。具有两个基因的物种,一

个是组成型表达和合成代谢,而另一种是诱导型和分解代谢(25-27)。这些基因提供细

胞壁生物合成所需要的D-丙氨酸,并通过敲除这些细菌的几个基因的研究确定,在无外源

D-丙氨酸时丙氨酸消旋酶对生长是必不可少的。某些细菌中,产生D-丙氨酸的另一种途

径,是利用D-氨基酸转氨酶。例如,在单核细胞增生李斯特氏菌中,dal和dat基因,分

别编码丙氨酸消旋酶和D-氨基酸转氨酶,必须都失活以产生D-丙氨酸营养缺陷体

(29)。这也是事实,对于某些细菌具有一个D-氨基酸转氨酶,如枯草芽孢杆菌,丙氨

酸消旋酶在丰富和最小含量L-丙氨酸(2,8,28)培养基已被证明是必要的。

在分枝杆菌,关于丙氨酸的必要性的数据到目前为止仍有争议。耻垢分枝杆菌研究表

明,即使在D-丙氨酸缺乏时,丙氨酸消旋酶对生长是非必需(4)。在该研究中的丙氨酸

消旋酶基因插入失活。虽然这种失活不是致命的,但是突变显示大大降低增长能力和对D-

环丝氨酸的高度灵敏,这是丙氨酸消旋酶的一种抑制剂。该作者将意想不到的结果归于可

能存在另外一个D-丙氨酸的合成的替代的途径,有可能涉及D-氨基酸转氨酶。然而,随后

2

的耻垢分枝杆菌mc155基因组的公布却未能显示出任何显著同源性的D-氨基酸转氨酶。

另外,萨塞蒂等具有里程碑意义的研究,通过划定全基因组转座子插入失活所有生长所必

需的结核分枝杆菌基因,表明丙氨酸消旋酶明显对生长必需(21)。因为结核分枝杆菌和

耻垢分枝杆菌之间的这个意外的差异,而且由于最近耻垢分枝杆菌表现出极大的效用可代

替结核分枝杆菌用于抗结核药物的设计(1),我们决定重新研究这个问题。

耻垢分枝杆菌alr基因的缺失导致需D-丙氨酸才能生长。该ALR基因在耻垢分枝杆菌

2

mc155失活(23)是通过将其99%的编码序列替换为来自pUC18K的卡那霉素抗性编码序

列(表1)生长和诱变使用的标准协议的如先前所述(30)。所有常规克隆均在大肠杆菌

DH10B中进行,培养于初始pH7.0,37℃下在LB培养基或在LB琼脂板(20)。当需要

时,蔗糖加入10%到平板(重量/体积),和卡那霉素,潮霉素,和庆大霉素分别使终浓

度为25,50和5微克/毫升。alr

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