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高效液相色谱法操作规程（药典）

高效液相色谱法试验操作规程

目的：建立一个高效液相色谱法试验操作规程，保证此项工作顺

利进行。

范围：原料、中间体、成品检验。

责任：检验员、QA监控员、化验室主任、质保科科长、质量部负

责人。

内容：

高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充

剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入

柱内，各成分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处

理系统记录和处理色谱信号。

1.对仪器的一般要求和色谱条件

高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分

仪或数据处理系统组成。色谱柱内径一般3.9～4.6mm，填充剂粒径

为3～10μm。超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐

超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。

1.1色谱柱

反向色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱

柱。常用的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等。常用的填充剂

有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。

正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的

色谱柱。常用的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。氨

基键合硅胶和氰基键合硅胶也可作反向色谱。

离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。有阳离

子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。

手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。

系统使用离子交换填充剂；分子排阻色谱系统使用凝胶或高分子

多空微球等填充剂；对应异构体的分离通常使用手性填充剂。

色谱柱的内径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、

表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密

与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择

合适的色谱柱。

温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，

应注意室温变化的影响。为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，

但不宜超过60℃。

残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相pH值一般应在2~8之

间。残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐

受更广泛pH值的流动相，适合于pH值小于2或大于8的流动相。

1.2检测器

最常用的检测器为紫外-可见分光光度计检测器，包括二极管阵列

检测器（DAD）、其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测

器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。

紫外-可见分光光度计检测器、荧光检测器、电化学检测器为选择

性检测器，其响应值不仅与被测物质的量有关，还与其结构有关；蒸

发光散射检测器和示差折光检测器为通用型检测器，对所有的物质均

有响应；结构相似的物质在蒸发光散射检测器的响应值几乎仅与被测

物质的量有关。

紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器和示差折光检

测器的响应值与被测物质的量在一定范围内呈线性关系，但蒸发光散

射检测器的响应值与被测物质的量通常呈指数关系，一般需经对数转

换。

不同的检测器，对流动相的要求不同。紫外-可见分光检测器所用

流动相应符合紫外-可见分光光度法(通则0401)项下对溶剂的要求；采

用低波长检测时，还应考虑有机

溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测

器和质谱检测器不得使用含不挥发性盐的流动相。

1.3流动相

反相色谱系统的流动相常用甲醇-水系统和乙腈-水系统，用紫外

末端波长检测时，宜选用乙腈-水系统。流动相中应尽可能减少不用缓

冲盐，如需用时，应尽可能使用低浓度缓冲盐。用十八烷基硅烷键合

硅胶色谱柱时，流动相中有机溶剂一般应不低于5%，否则易将导致柱

效下降、色谱系统不稳定。

正相色谱系统的流动相常用两种或两种以上的有机溶剂，如二氯

甲烷和正己烷等。

品种正文项下规定的条件除填充剂种类、流动相组分、检测器类

型不得改变外，其余如色谱柱内径与长度、填充剂粒径、流动相流速、

流动相组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等，均可适当改变，

以达到系统适用性试验的要求。调整流动相组分比例时，当小比例组

分的百分比例X小于等于33%时，允许改变范围为0.7X~1.3X;当X大

于33%时，允许改变