PCR扩增原理及操作.pdfVIP

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去留无意，闲看庭前花开花落；宠辱不惊，漫随天外云卷云舒。——《幽窗小记》

PCR扩增反应的操作

第一节PCR扩增反应的基本原理

一、聚合酶链式反应（PCR）的基本构成

PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）

的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术，在分子生物学

中有广泛的应用，包括用于DNA作图、DNA测序、分子系统遗传学等。

PCR基本原理是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，

用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。在微量离心

管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA

2+

膜板、四种dNTP溶液、耐热TaqDNA聚合酶、Mg等。反应时先将上述溶液加热，使模板DNA在

高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，

形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在TaqDNA聚合酶的催化下，以dNTP为原料，

引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改

变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。

因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA

链延伸合成（见图）。

1．模板DNA的变性

模板DNA加热到90~95℃时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性，

以便它与引物结合，为下轮反应作准备。变性温度与DNA中G-C含量有关，G-C间由三个氢键连接，

而A-T间只有两个氢键相连，所以G-C含量较高的模板，其解链温度相对要高些。故PCR中DNA

变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。对于高G-C含量

的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜（DMSO），并且在PCR循环中起始阶段热变性温度可

以采用97℃，时间适当延长，即所谓的热启动。

2．模板DNA与引物的退火

将反应混合物温度降低至37~65℃时，寡核苷酸引物与单链模板杂交，形成DNA模板-引物复

合物。退火所需要的温度和时间取决于引物与靶序列的同源性程度及寡核苷酸的碱基组成。一般

要求引物的浓度大大高于模板DNA的浓度，并由于引物的长度显著短于模板的长度，因此在退火

时，引物与模板中的互补序列的配对速度比模板之间重新配对成双链的速度要快得多，退火时间

一般为1～2min。

3．引物的延伸

DNA模板-引物复合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱

基配对与半保留复制原理，合成一条与模板DNA链互补的新链。重复循环变性-退火-延伸三过程，

就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。延伸所需要的时间

取决于模板DNA的长度。在72℃条件下，TaqDNA聚合酶催化的合成速度大约为40～60个碱基/

秒。经过一轮“变性-退火-延伸”循环，模板拷贝数增加了一倍。在以后的循环中，新合成的DNA

都可以起模板作用，因此每一轮循环以后，DNA拷贝数就增加一倍。每完成一个循环需2～4min，

一次PCR经过30～40次循环，约2～3h。扩增初期，扩增的量呈直线上升，但是当引物、模板、

聚合酶达到一定比值时，酶的催化反应趋于饱和，便出现所谓的“平台效应”，即靶DNA产物的浓

度不再增加。