DB45T 1856-2018 蛤蚧及其伪品COI条形码鉴别技术规程.docxVIP

ICS65.020.30B38

DB45

广西壮族自治区地方标准

DB45/T1856—2018

蛤蚧及其伪品COI条形码鉴别技术规程

IdentificationofGekkogeckoLinnaeusandAdulterantsUsingtheCOIBarcode

2018-10-20发布2018-11-20实施

广西壮族自治区质量技术监督局发布

I

DB45/T1856—2018

目次

前言 II

1范围 1

2术语和定义 1

3鉴别程序 2

附录A（规范性附录）蛤蚧伪品 3

附录B（规范性附录）蛤蚧及其伪品COIDNA序列 4

II

DB45/T1856—2018

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由广西壮族自治区卫生和计划生育委员会提出。本标准由广西卫生标准化技术委员会归口。

本标准起草单位：广西壮族自治区药用植物园。

本标准主要起草人：徐永莉、李力、闫志刚、张月云、赵成坚、黄勇、谷颖乐。

1

DB45/T1856—2018

蛤蚧及其伪品COI条形码鉴别技术规程

1范围

本标准规定了蛤蚧（Gekkogecko）及其伪品的COI条形码鉴别的术语和定义、鉴别程序。本标准适用于广西境内蛤蚧及其伪品COI条形码的鉴别。

2术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。2.1

蛤蚧Gekkogecko

蛤蚧（Gekkogecko）属爬行纲Reptilia、有鳞目Squamata、壁虎科Gekkonidae、壁虎属Gekko。蛤蚧药材为除去内脏的干燥体。包括黑点蛤蚧和红点蛤蚧。

2.2

蛤蚧伪品Gekkogeckoadulterants

市场上当蛤蚧销售和使用的动物。详见附录A。2.3

DNA条形码DNAbarcoding

生物体内能够代表该物种的标准的、有足够变异的、易扩增且较短的DNA片段。2.4

COI

细胞色素c氧化酶亚基I(cytochromecoxidasesubunitI，COI)，线粒体基因组的蛋白质编码基因。

2.5

COI条形码COIbarcoding

集中存在于动物线粒体细胞色素C氧化酶亚单位I(COI)特定区段的一段大约有650个碱基的DNA序列。

2.6

近邻相接法neighbor-joiningmethod(NJ法)

一种研究DNA而建立亲缘关系的方法，由序列建立支序图或亲缘关系图。

2

DB45/T1856—20182.7

bp

碱基对。

3鉴别程序

3.1鉴别条件

PCR扩增仪、核酸电泳仪和水平电泳槽、凝胶成像系统、组织基因提取试剂盒、序列比对软件。3.2引物序列

LCOI490：5—GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG—3。HCO2198：5—TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA—3。

3.3DNA的提取

取药材样品，75％乙醇表面消毒，用灭菌手术刀，取样品皮下肌肉约30mg,剪碎，DNA提取研磨仪研磨2min，用组织基因提取试剂盒提取总DNA，提取步骤参见各产品使用说明书。

3.4PCR扩增

反应体积为25μL，所加试剂包括5U/μLTaqDNA聚合酶(TaKaRa)0.5μL，10mmol/LdNTP1μL，10pmol/μL上下游引物各0.5μL，10×PCRbuffer2.5μL，Mg2+1.5μL，DNA模板1μL。PCR反应在PCR扩增仪上进行，反应参数为：95℃3min，(94℃45s，55℃45s，72℃45s）×39，72℃5min，4℃保存。

3.5电泳

将PCR产物5μL与上扬染料3μL混合，加入1.5％琼脂糖凝胶的点样孔中，同时设100bp梯度DNA标准分子量作为片段大小的标准。100V电压电泳约40min。

3.6成像及分析

将电泳后的琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统观察窗内，观察分析并成像保存。3.7DNA样品测序

凝胶上出现一条600bp大小的特异性条带PCR扩增产物用试剂盒对PCR扩增的样品进行纯化，纯化的步骤参见各产品使用说明书，将检测