PCR、Western blot、免疫组化(实验原理).pdfVIP

其身正，不令而行；其身不正，虽令不从。——《论语》

PCR实验原理：

聚合酶链式反应简称PCR（PolymeraseChainReaction）是体外酶促合成特

异DNA片段的一种方法，是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下，

依赖于DNA聚合酶的酶促合反应，将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核

苷酸链引物经“高温变性—低温退火—引物延伸”三步反应的多次循环，使DNA

片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片

段，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其结果都是以原来的

DNA为模板产生新的互补DNA片段。相比于细胞内复杂的DNA复制，PCR的

反应体系相对较简单。其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。反应

体系包括cDNA模板、引物、dNTP、PCR缓冲液、Taq聚合酶等。

PCR由变性—退火—延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA

双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，

为下轮反应做准备；

②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降

至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：DNA模板—引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反

应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板

DNA链互补的半保留复制链。

重复循环变性—退火—延伸这三个过程，就可获得更多的“半保留复制链”，

而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3

小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

其身正，不令而行；其身不正，虽令不从。——《论语》

PCR的反应动力学

PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的

DNA扩增量可用Y=(1+X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平

均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实

际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形

式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线

性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期。

设计引物应遵循以下原则：

①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。

②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。

③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多

易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的

成串排列。

④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，

否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。

⑤引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避

免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位

点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。

⑦引物的特异性：引物应与核酸