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为天地立心，为生民立命，为往圣继绝学，为万世开太平。——张载

PCR技术的原理与方法

为天地立心，为生民立命，为往圣继绝学，为万世开太平。——张载

PCR定义

PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DN

A为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA

互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DN

A。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。

PCR技术的基本原理

一.PCR反应成分：

1.模板DNA；2.引物；3.四种脱氧核糖核苷酸；

4.DNA聚合酶；5.反应缓冲液、Mg2等。

二.PCR反应基本步骤：

1.变性：高温使双链DNA解离形成单链（94℃，30s）。

2.退火：低温下，引物与模板DNA互补区结合（55℃，30s）。

3.延伸：中温延伸。DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应（70～72℃，30～60s）

1.变性(denaturation)：通过加热使模板DNA的双链之间的氢键断裂，双链分开而成单链的过程。

2.退火(annealling)：当温度降低时，引物与模板DNA中互补区域结合成杂交分子。

3.延伸(extension)：在DNA聚合酶、dNTPs、Mg2存在下，DNA聚合酶催化引物按5’→3方’向延

伸，合成出与模板DNA链互补的DNA子链。

以上述三个步骤为一个循环，每一循环的产物均可作为下一个循环的模板，经过n次循环后，目的

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n

DNA以2的形式增加。

•PCR扩增的基本方法

•PCR反应的成分和作用

总体积：一般为25μl～100μl

（一）无Mg2buffer：由纯水、kcl、Tris组成。Tris用于调节反应体系pH值，使Taq酶在偏碱性

环境中反挥活性。kcl可降低退火温度，但不能超过50mmol/L，否则会抑制DNA聚合酶活性。

（二）Mg2:终浓度为1.5～2.0mmol/L，其对应dNTP为200μmol/L，注意Mg2与dNTPs之间的

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3.延伸：延伸温度应在Taq酶的最适温度范围之内，一般在70～75℃。延伸时间要根据DNA聚合

酶的延伸速度和目的扩增片段的长度确定，通常对于1kb以内的片段1min是够用的。

循环数：

PCR的循环数主要由模板DNA的量决定，一般20～30次循环数较合适，过多的循环数会增加非特

异扩增产物，具体要多少循环数可通过预试验确定。

PCR产物积累规律：

n

反应初期产物以2呈指数形式增加，至一定的循环数后，引物、模板、DNA聚合酶形成一种平衡，

产物进入一个缓慢增长时期（“停滞效应”），即“平台期”。到达平台期所需PCR循环数与模板量、

PCR扩增效率、聚合酶种类、非特异产物竟争有关。

•PCR扩增仪

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PCR常见问题

一.没有扩增产物

1.循环温度：变性温度、退火温度