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非淡泊无以明志，非宁静无以致远。——诸葛亮

前言

中心法则：

非淡泊无以明志，非宁静无以致远。——诸葛亮

第一章PCR

一、概念：

PCR(聚合酶链式反应，PolymeraseChainReaction）是利用DNA在体外摄氏

95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补

配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚

合酶沿着磷酸到五碳糖(5-3)的方向合成互补链。

二、原理：

DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作

用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复

制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，

当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复

性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序

列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至95℃左右一定时间后，使模板DNA

双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，

为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性

成单链后，温度降至60℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③

引物的延伸：DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合

酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对原则与半

保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变

性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为

下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因

扩增放大几百万倍。

非淡泊无以明志，非宁静无以致远。——诸葛亮

三、引物

PCR反应中有两条引物，即5′引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链

为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA

序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。

引物设计的基本原则

①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右，Tm值在60℃比较好。

②引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易

出现非特异条带。

常用引物设计软件有：PrimerPremier5.0、VectorNTISuit、DNAstar等

Tm值：

Tm值就是DNA熔解温度，指把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度。不

同序列的DNA，Tm值不同。DNA中G－C含量越高，Tm值越高，成正比关系。

Tm计算公式为：Tm=4℃(G+C)+2℃(A+T)

四、示意过程：

例如：TaqPlusDNAPolymerase(P201)

反应体系：

DDW