人教版教学课件生物选修1之蛋白质的提取和分离.pptVIP

试管中溶液层次甲苯层（无色透明）白色薄层固体红色透明液体杂质沉淀层（暗红色）返回4.透析血红蛋白20mmol/L磷酸缓冲液1mL1mL利用透析袋透析透析过程返回课题3血红蛋白的提取与分离教材图5－19纯化－－凝胶色谱操作凝胶色谱柱的制作：凝胶色谱柱的装填：样品的加入和洗脱（二）凝胶色谱操作凝胶色谱柱的制作：①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。⑤安装其他附属结构。装配好的凝胶柱返回课题3血红蛋白的提取与分离材料：交联葡聚糖凝胶G-75；20mmol/L磷酸缓冲液装填:2.凝胶色谱柱的装填：步骤操作要求①②③④⑤立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h洗涤平衡一次性缓慢倒入；轻轻敲打装填悬浮液凝胶颗粒＋洗脱液→沸水浴凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀根据色谱柱体积计算凝胶用量色谱柱垂直固定在支架上配制悬浮液计算称量凝胶固定色谱柱凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。凝胶的前处理：配制凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。（2）凝胶色谱柱的装填④洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时。注意：1、洗脱液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。血红蛋白含有四条肽链,每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。课题3血红蛋白的提取和分离专题5DNA和蛋白质技术学生活动1:一、基础知识:1、分离生物大分子的基本思路是什么？2、不同蛋白质的特性在哪些方面存在差异？3、本课题我们将利用血红蛋白与杂质蛋白哪方面的差异进行提纯？4、为什么不用鸡的血红细胞而用人的血红细胞作为实验材料？5、用什么方法分离相对分子质量不同的蛋白质？一、基础知识--蛋白质提取和分离原理蛋白质提取与分离的依据－－蛋白质的物理化学性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别。提取分离方法凝胶色谱法凝胶电泳法(一)凝胶色谱法（1）原理：（2）材料大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。多孔性的多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。(一)凝胶色谱法（3）分离过程混合物上柱洗脱大分子流动快小分子流动慢收集大分子收集小分子洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。(一)凝胶色谱法㈠凝胶色谱法（分配色谱法）：1、什么是凝胶？2、什么是凝胶色谱法？学生活动2:3、凝胶色谱法的原理是什么？4、请用自己的话总结出凝胶色谱法分离相对分子质量不同蛋白质的具体过程。缓冲液的作用是什么？缓冲液是如何配制的？你所学过的人体血液的缓冲物质有哪些？本实验加的是什么缓冲液？为何要加缓冲液？、什么是缓冲液？学生活动3:（二）、缓冲溶液01020304由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成。如H2CO3/NaHCO3，醋酸/醋酸钠，NaH2PO4/Na2HPO4等调节缓冲剂的比例，可配制不同pH的缓冲液。缓冲溶液－－洗脱剂组成：配制：作用：抵制外界酸碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。05缓冲溶液、什么是电泳？电泳分离各种分子的原理是什么？、请描述电泳的过程？影响电泳迁移速度的因素有哪些？如何消除电荷对电泳迁移速度的影响？学生活动4:（三）、电泳(三)电泳2．凝胶电泳法：（1）原理：不同蛋白