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制备芯片的完整流程

1．ROUNDA

（1）逆转录反应合成第一链:(试剂用的是SuperII的)

阴性对照:水;阳性对照:HeLa细胞RNA(50ng)

在0.5mlEp管中，加入5ulRNA（病毒的）或1ulRNA（细胞的）及1ulprimerA(40mM，随

机引物)或特异性下游引物1ul，补水使终体积为10ul，65°C,5min，室温冷却5min，再

加入10uLof2Xenzymemix（事先配制好）；配方如下：

2Xenzymemix

2.0ul10XRTBuffer

0.4ul25mMdNTPmix(finalconcentration500uMeachnucleotide)

3.6ulHO

2

2.0ul0.1MDTT

2.0ulReverseTranscriptase(SuperII)

42°C,30min；65°C5min；室温5min；

加入1uLRT

再进行：42°C,30min。

(2)用Sequenase合成第二链：

上面样品加热94°C2min，迅速冷却至10°C，并在10°C放置5min.

加入10uLSequenasemix（事先配制好）（配方见下），使RXN总体积为30uL

SequenaseMix

2.0ul5XSequenaseBuffer

7.7ulHO

2

0.3ulSequenase

缓慢从10°C加热至37°C，加热时间为8min以上；

然后37°C放置8min;迅速加热至94°C，并在94°C保持2min；

迅速冷却至10°C，并在10°C放置5min，放置期间加入1.2ul稀释后的Sequenase(1:4稀释)

缓慢从10°C加热至37°C，加热时间为8min以上；

然后37°C放置8min;迅速加热至94°C，并在94°C保持8min；

2．ROUNDB（PCR反应，试剂用的是Fermentas的）

RoundA模板6

25mMMgCl28

10XPCRBuffer10

25mMdNTP1（事先配好）

PrimerB(100pmol/ul)1

TaqPolymerase(hotstart)1

Water73(使总体积为100ul即可)

RoundBCycles:

30sec94°C

30sec40°C

30sec50°C

1min72°C

Run35cycles。

PCR结果在1％琼脂糖凝胶电泳，在500bp-1kb之间应当有一DNAsmear，要确保阴性对照中无

DNA条带。

3．ROUNDC

RoundB模板10100XmodifieddNTPmix配方

25mMMgCl28（注意浓度）25mMdATP

10XPCRBuffer1025mMdCTP

100XmodifieddNTPmix125mMdGTP

PrimerB(100pmol/ul)110mMdTTP

Taq115mMaa-dUTP

Water69或68(使总体积为100ul即可)以上各试剂浓度都是100mM

30sec94°C

30sec40°C

30sec50°C

1min72°C

20cycles

4.纯化aa-dUTP标记的cDNA

为继续后面aa-dUTP（氨基丙烯－dUTP）与Cy