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荧光定量pcr的基本原理讲稿

荧光定量聚合酶链反应（qPCR）是一种基于PCR技术的高灵敏度、高特异性的

DNA定量方法。该方法通过在PCR反应过程中使用特定的荧光信号，实时监测

扩增产物的累积情况，从而确定起始模板的数量。本文将以1500字以上的篇幅，

详细介绍荧光定量PCR的基本原理。

一、PCR的基本原理

PCR是一种体外扩增DNA特定片段的技术，它基于DNA的复制过程。PCR反

应体系中包含目标DNA序列、引物、dNTPs、聚合酶和缓冲液等多种组分。PCR

反应主要分为三个步骤：变性、退火和延伸。

1.变性

PCR反应开始时，反应体系中的DNA双链被高温（通常为94-98C）变性为两

条单链，并释放出目标序列片段。

2.退火

PCR反应体系降温至退火温度（通常为55-65C），引物特异性结合到目标序列

的两条单链上。引物的选取通常需要考虑引物的长度、GC含量、特异性等因素。

3.延伸

PCR反应体系升温至延伸温度（通常为72C），聚合酶沿引物向下游延伸合成新

的DNA链。该过程有高效率的DNA合成。

以上三个步骤组成了PCR的循环体系，反复进行循环扩增，可在短时间内从一

条目标DNA序列扩增到数百万条，从而实现了DNA定性和定量。

二、荧光定量PCR的原理

荧光定量PCR（qPCR）基于PCR技术，引入了用于荧光信号的特定探针，通

过实时监测荧光信号的强度来定量目标DNA。荧光定量PCR主要包括两种类型

的探针：DNA靶向探针和荧光染料。

1.DNA靶向探针

DNA靶向探针是一种特异性结合到目标序列的短链DNA分子，其中至少含有

一个荧光物质和一个阻尼剂。典型的DNA靶向探针包括TaqMan探针、分子别

探针、Beacon探针等。这些探针与目标序列的结合会导致探针内的荧光物质被

释放出来，从而产生荧光信号。

2.荧光染料

荧光染料是一种无靶向结合到DNA的分子，其荧光性能会受到DNA的存在而

发生变化。典型的荧光染料包括SYBRGreen、EvaGreen等。这些染料与PCR

反应体系中的DNA结合后，其荧光性能会发生可逆性变化，从而可以通过监测

荧光信号的增强来定量DNA。

三、荧光定量PCR的操作步骤

荧光定量PCR的操作步骤主要包括：荧光染料测定、DNA模板制备、引物的设

计与合成、扩增体系的组装、PCR反应条件的优化、荧光信号的监测和数据分

析等。

1.荧光染料测定

选择合适的荧光染料用于荧光定量PCR反应，例如SYBRGreen等，然后测定

该荧光染料的适用浓度，以保证最佳的荧光信号强度和特异性。

2.DNA模板制备

从待测样品中提取目标DNA，使用合适的方法制备纯度高、浓度适中的DNA

模板。质量好的DNA模板可以保证PCR反应的特异性和灵敏度。

3.引物的设计与合成

根据目标序列的特点，设计匹配无错误互补的引物序列。通常选择长度为18-24

个碱基对、GC含量为40-60%，并避免引物内部及引物与引物之间的相互结合。

4.扩增体系的组装

按照qPCR试剂的配方和浓度，准备合适的PCR反应体系。PCR反应体系主要

包括DNA模板、引物、荧光染料、dNTPs、聚合酶、缓冲液和辅助物质等。

5.PCR反应条件的优化

通过调整PCR反应体系的温度参数、荧光信号相关的参数等，优化PCR的反应

条件，以提高扩增效率和特异性。

6.荧光信号的监测和数据分析

在PCR反应过程中使用合适的仪器监测荧光信号的强度变化。可以使用实时荧

光定量PCR仪器记录检测信号并转化为实时荧光增长曲线，通过对荧光信号的

分析，计算出初级数量。

四、荧光定量PCR的应用

荧光定量PCR具有高灵敏度、高特异性和宽动态量程等优点，广泛应用于基因

表达分析、病原体检测、基因突变分析、遗传多态性鉴定、药物筛选和临床诊断

等领域。在医学和生命科学研究中，荧光定量PCR已成为常用的分子诊断