《疏水层析HI》课件.pptVIP

**********************疏水层析HI疏水层析是一种根据蛋白质的疏水性进行分离的技术。通过使用疏水性树脂，可以将蛋白质按照其疏水性大小进行分离。疏水层析在生物制药领域有着广泛的应用，例如纯化重组蛋白、抗体等。课程目标11.了解疏水层析的基本原理熟悉疏水层析的操作步骤和影响因素。22.掌握疏水层析的应用范围了解疏水层析在蛋白质、核酸、中药等领域的应用。33.熟悉疏水层析仪器的结构和操作了解疏水层析仪器的基本原理，掌握仪器的使用和维护方法。44.培养独立解决问题的能力能够独立完成疏水层析实验，并进行数据分析和结果解读。疏水层析简介疏水层析是一种常用的色谱分离方法，利用蛋白质或其他生物大分子与疏水性固定相之间的相互作用来实现分离。疏水层析是一种利用蛋白质或其他生物大分子疏水性差异进行分离的技术，它在生物化学和生物制药领域有着广泛的应用。疏水层析主要用于分离蛋白质、多肽、核酸等生物大分子，也可用于分离小分子有机化合物。疏水层析是一种重要的分离纯化技术，可用于制备高纯度的生物大分子，并为后续的结构分析和功能研究奠定基础。疏水层析的特点选择性强疏水层析利用蛋白质表面的疏水性差异，实现分离。分辨率高疏水层析可以有效分离蛋白质、肽类等生物大分子，获得高纯度产品。操作简便疏水层析操作简单，易于掌握，便于大规模生产。应用广泛疏水层析应用于蛋白质纯化、药物分离、食品分析等领域。疏水层析的机理疏水层析是基于蛋白质表面疏水性的差异进行分离的一种色谱方法。疏水相互作用是蛋白质表面疏水基团与疏水基团间的弱相互作用。1蛋白质结合疏水性蛋白质与疏水树脂结合2洗脱加入高浓度有机溶剂，降低疏水性3分离不同疏水性的蛋白质被分离疏水层析操作参数流动相疏水层析的流动相通常使用水溶液，可以添加盐、有机溶剂或其他添加剂来调节疏水性。流动相的组成和pH值会影响样品的洗脱行为，需要进行优化。流速流速过高会导致分离效果下降，过低则会延长分析时间。流速的优化需要考虑样品性质和层析柱尺寸。温度温度升高会降低疏水性，影响分离效果。温度的控制可以优化分离效果，提高样品回收率。压力压力过高会导致层析柱破损，过低则会降低分离效率。压力控制需要考虑层析柱的耐受范围和样品性质。疏水层析的样品预处理1去除杂质样品预处理主要目的：去除可能干扰层析分离的杂质，提高分离效率。常用的方法包括：过滤、离心、超滤等。2调节样品浓度将样品浓度调整到适合疏水层析的范围，保证上样量和分离效果。3选择合适的缓冲液根据样品性质和疏水层析树脂的特性，选择合适的缓冲液，保证样品的稳定性和分离效果。疏水层析树脂的选择苯基树脂苯基树脂广泛应用于蛋白质分离，特别是具有疏水性或疏水性区域的蛋白质。辛基树脂辛基树脂比苯基树脂更疏水，可用于分离更疏水的蛋白质。烷基树脂烷基树脂是疏水性更强的树脂，适用于分离疏水性强的蛋白质。平衡缓冲液的配制确定缓冲液体系根据疏水层析树脂类型和目标蛋白质性质，选择合适的缓冲液体系，例如磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液等。调整缓冲液pH值使用pH计精确调整缓冲液pH值至目标值，以确保最佳层析条件。添加盐类和添加剂根据需要添加盐类，例如NaCl或KCl，以调节离子强度，并可添加其他添加剂，例如非离子型去垢剂，以提高蛋白质的溶解度。过滤除菌使用0.22μm滤膜过滤缓冲液，去除细菌和颗粒，确保层析过程的洁净度。淋洗缓冲液的配制1选择合适的缓冲体系根据分离目标蛋白的性质选择合适的缓冲液体系2调节缓冲液pH值使用酸或碱调节缓冲液pH值至目标值3添加盐类加入适当浓度的盐类，增强蛋白质的疏水相互作用4过滤除菌使用0.22μm孔径的滤膜过滤缓冲液，去除细菌等杂质淋洗缓冲液的配制是疏水层析的关键步骤之一。缓冲液的组成和pH值会直接影响蛋白质的洗脱行为。需要根据实验需求选择合适的缓冲液体系，并调整pH值、盐浓度和添加剂等参数，以达到最佳的分离效果。样品上样和加样操作样品预处理确保样品溶液的pH值和离子强度与平衡缓冲液相匹配，并去除可能干扰分离的杂质。上样量根据树脂的容量和样品浓度选择合适的样品上样量，避免过载导致分离效果下降。加样方式选择合适的加样方式，例如注射器、泵或蠕动泵，确保样品均匀地进入色谱柱。洗脱步骤1开始洗脱根据预设条件选择合适的洗脱缓冲液2梯度洗脱缓慢增加洗脱液浓度，逐步洗脱目标蛋白3收集馏分根据峰形收集不同组分的蛋白馏分4检测分析使用合适的检测方法检测收集的馏分洗脱过程是疏水层析的关键步骤，需要根据目标蛋白的性质和分