生化技术凝胶过滤.ppt

分离对象：溶解度、带电性等理化性质相似而分子质量不同，或者是聚合度不等的混合物溶液实例：SephadexG-200层析纯化AFP制备Ag-Ab复合物溶于少量0.1mol/LGly-HCl缓冲液中，并用本液透析2h上SephadexG-200柱得AFP峰置0.1mol/L柠檬酸-磷酸缓冲液（pH4.8）透析上柱洗脱AFP纯品二、分离生命物质第58页,共70页，星期六，2024年，5月第59页,共70页，星期六，2024年，5月第60页,共70页，星期六，2024年，5月热源物质：指微生物产生的分子量很大的某些多糖蛋白复合物等，能使人体发热的物质材料：SephadexG-25（80~120目）特点：比活性炭吸附、离子交换吸附等方便实例：用SephadexG-25凝胶层析除去氨基酸粗品中的热源质：利用热源（大分子蛋白类）的Kav=0，而氨基酸的Kav≈1，将试剂量控制在柱体积的20~30%，能实现完全分离三、去热源物质第61页,共70页，星期六，2024年，5月原理：Kav=－blgM+c或lgM=a－dKav(M为分子质量，常数a、b、c、d均大于0)先做标准曲线，再在相同条件下测样品Kav也可用以下4个指标代替①Ve－Vo：分离体积②Ve/Vo：相对保留体积（另R＝Vo/Ve）③Ve/Vt：简化的洗脱体积，受柱的填充情况的影响较小④Ve：洗脱体积特点：简便实用，所需样品量较少四、测定分子质量第62页,共70页，星期六，2024年，5月①pH6~8的范围内，曲线线性才比较好；而在极端pH时，由于变性等原因易偏高②一般适用于球状pro的分子量测定，而纤维状pro不合适③糖蛋白中若糖的比例＞5％时，测定结果偏大④不受变性剂如尿素和盐酸胍的影响⑤有些酶类不适用。如淀粉酶，能与葡聚糖凝胶形成络合物，这种络合物与酶-底物络合物相似，因此在凝胶层析时有异常反应用凝胶过滤法测定分子量的局限性第63页,共70页，星期六，2024年，5月第64页,共70页，星期六，2024年，5月第65页,共70页，星期六，2024年，5月第66页,共70页，星期六，2024年，5月第67页,共70页，星期六，2024年，5月若在Sephadex分子上连接DEAE、羧甲基或磺酸乙基等离子基团，可使凝胶在具有分子筛基础上，还具有离子交换能力，大大提高Sephadex在生化制药中的应用范围如：DEAE-SephadexA-25可用于制备无热原物质的去离子水五、其他第68页,共70页，星期六，2024年，5月4．在凝胶层析柱中分离某有效成分时，洗脱体积为140ml，其外水体积和总体积分别为60ml和200ml，求分配系数是多少?思考题解：Ve=Vo+Kav×（Vt－Vo）140=60+Kav×（200－60）Kav=0.57第69页,共70页，星期六，2024年，5月感谢大家观看第70页,共70页，星期六，2024年，5月各组分间的值差异越大，分离效果越好；差异越小,则分离效果很差，或根本无法分离流出物用部分收集器等量或等时收集，检测后分段合并相同组分的各管流出物，得到分子量不同的各种组分第26页,共70页，星期六，2024年，5月1、当Kav=0时，则Ve=Vo，即对于根本不能进入凝胶内部的大分子物质全排阻，洗脱体积等于空隙体积即外水体积（图中组分Ⅰ）2、当Kav=1时，Ve=Vo+Vi。即小分子可完全渗入凝胶内部时，洗脱体积应为空隙体积与内水体积之和。Ve=Vo+Vi（图中组分Ⅲ）第27页,共70页，星期六，2024年，5月3、当0＜Kav＜1时，Ve=Vo+Kav（Vi＋Vg）。表示固定相中只有一部分可被组分扩散渗入，一部分被排阻，Ve即在Vo与Vo+Vi＋Vg之间变化（图中组分Ⅱ）4、有时Kav＞1，表示凝胶对组分有吸附作用（从内水中洗脱出来的含量下降），此时Ve＞Vo+Vi＋Vg。例如一些芳香族化合物如苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸等在SephadexG-25中的洗脱体积远超出理论计算的最大值第28页,共70页，星期六，2024年，5月二、值的测定只要测出、和，即可计算出值的测定：（1）计算法：（2）测定法：第29页,共70页，星期六，202