《杂交育种》PPT课件-(2).ppt

*砂芯漏斗：漏斗的砂芯滤板由烧结玻璃料制成，可以过滤酸液和用酸类处理，也叫耐酸漏斗。根据其孔径大小，砂芯滤板可分成G1~G6六种规格。原生质体大量从菌体细胞中释放后，酶解结束，必须将原生质体与酶液和未酶解的残余菌体及碎片分开，通常采用离心的方法。以提高原生质体纯度，满足融合的要求。*②酚藏花红染色法．用0.01％浓度的染料染色，活性原生质体能吸收酚藏花红染料而成红色，无活性的死细胞不能吸收染料呈白色；③伊文思蓝染色法，用浓度为0.25％的伊文思蓝染色，活性原生质体不吸收染料为无色，死的无活性细胞吸收染料呈蓝色*原生质体活性与其新鲜程度有关，一般都是将新制备的原生质体立即进行融合或其他方式育种。**④再生培养基组成。培养基中的碳源会影响微生物原生质体的复原率。丝状真菌、酿酒酵母等的原生质体仅能在固体培养基上再生。再生培养基要用稳定剂配制，还含有Ca2＋和Mg2＋，浓度和原生质体形成时的酶解液相类似，菌种不同稍有差别。磷酸盐浓度要控制适当，不宜过高，否则影响再生率。*因为去壁后的原生质体不能承受较强的机械作用，否则易于破裂，不宜用玻璃棒在平板上涂抹分离。酿酒酵母和产朊假丝酵母等出芽酵母的原生质体在液体培养基中难于再生，只有埋在固体培养基中才能达到理想效果。*原生质体再生还与其结构有关，有不少原生质体细胞结构不完整，如缺乏细胞器，或没有细胞核，这些原生质体本身已失去活性，不能再生；有些原生质体细胞壁降解过于彻底，缺少细胞壁再生时所需的引物，也难以再生；有些原生质体具有残留细胞壁，比完全剥除细胞壁的更易于再生。***PEG的相对分子质量可分几种，适用的相对分子质量为1000－6000，**有学者研究认为，高温会降低PEG粘度，增加质膜流动性，有利于融合。*原生质体的再生、复原过程是一个复杂的生物学过程，其中包括细胞本身的调节和修复。*融合体中除重组体外，还有异核体或部分结合子、杂合二倍体或杂合系，这些都会在平板上形成菌落，检出融合体的方法有多种。*常用的方法有：菌体或孢子形态和大小的比较，DNA含量的测定比较，同工酶电泳谱带的比较，酶活性的测定，代谢产物组成和产量的分析比较与测定，对营养物质的利用以及超微结构的变化等。**直接选择法和非直接选择法各有优缺点，直接选择法只需要一步就可得到重组体，而且大多数重组体是稳定的，缺点是表型延迟的重组体不能检出。而非直接选择法能让细胞壁更好地再生、表型延迟重组体容易检出，但需要二步才能俭出重组体，而且复制平板得到的重组体是不太稳定的。不管直接选择法还是间接选择法，通常都要用营养缺陷型作为遗传标记。它们融合后获得的重组体不一定能提高目的产物的产量。*灭活亲株原生质体通常不带营养缺陷型标记*各类微生物之间融合频率差别很大，既使是同一个种的不同菌株也不一样。异种间融合率比同种间又低得多，如霉菌种间融合率约为10-2－10-3，放线菌为10-5－10-7。霉菌、放线菌融合率约为0.1％－l0％（10-1－10-3）**采用融合技术提高菌株产量的例子其他微生物原生质体育种近年来利用原生质体为材料的育种技术还有脂质体转移、原生质体转染，以及通过原生质体融合转移细胞器、细胞核等新方法。随着原生质体研究深入，将来利用它为材料的新技术必将越来越多，对工业微生物育种的影响也更加深人，为获得高产菌株发挥更大作用。****其主要过程为a.菌丝联结；b.质配（形成异核体）；c.核配；d.单倍体化***由于杂交育种重组频率极低，一般为10-7左右。杂交后的混合体系中除了极少数重组体外，还存在大量的未杂交亲本及无效杂交后代，增加重组体筛选难度。为了提高效率，加快重组体筛选和检出，让杂交亲本带上不同的遗传标记是十分重要的。**放线菌在杂交过程中也会形成异核体，但这种异核体与霉菌异核体不同，在复制过程中染色体不发生交换。***经过双交换后还可能产生极少数的单倍重组体。******优点:⑴原生质体本身较为敏感，制备过程中的各种化合物及环境中的物理因子(光、热、机械损伤、其他射线等)对染色体或质粒DNA都有一定诱变效应；⑵原生质体再生本质上是细胞壁重建和分裂能力恢复的过程，再生的细胞壁可能在组成与结构上都发生变化，甚至于产生可遗传的利于细胞代谢和产物外泌的变异；⑶制备原生质体的出发材料一般为对数生长期细胞，活力较强，对环境和诱变剂较为敏感，破壁与再生过程中又淘汰了大量弱势菌株，能再生的菌株不论初级代谢与次级代谢过程均较活跃，故高产优质正变菌株比例大；⑷原生质体再生材料无需经过遗传标记，减少了对菌株的损伤和优良性状的影响。