考研真题 《普通生物化学》（第5版）配套题库（真题 课后题 章节题 模拟题）_347-692.docx

5请列举三种蛋白质分子质量的测定方法，并简述其原理。

答：测定蛋白质相对分子质量的方法很多，如渗透、沉降速度法、沉降平衡法、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳等。现将详细说渗透压法、凝胶过滤法和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理方法：

(1)渗透压法：在理想溶液中，渗透压是浓度的线性函数，而与溶质的形状无关。所以可用渗透压计算蛋白质的相对分子质量。但是实际的高分子溶液与理想溶液有较大偏差，当蛋白质浓度不大时，可用公式计算。此方法简单准确，与蛋白质的形状和水化程度无关，但要求样品均一，否则测定结果是样品中各种蛋白的平均相对分子质量。

(2)凝胶过滤法：又称分子排阻层析或分子筛层析法。层析柱中填充凝胶颗粒，凝胶的网格大小可通过交联剂含量控制。小分子物质可进入网格中，流出慢；大分子被排阻在颗粒外，流经距离短，流出快。此方法较简单，但与分子形状有关。测相对分子质量时，标准蛋白的分子形状应与待测蛋白相同。

(3)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：蛋白质电泳时的迁移率与其所带净电荷、分子大

小和形状有关，加入SDS后，每克蛋白可结合1.4g

SDS,将原有电荷掩盖，而且使分子变成棒状。由于凝胶的分子筛效应，相对迁移率与蛋白相对分子质量的对数成线性关系；用已知相对分子质量的标准蛋白作标准曲线,即可求出未知蛋白的相对分子质量。

6测定蛋白质一级结构的基本策略是什么?

答：蛋白质的一级结构特指肽链中的氨基酸排序。多肽链的氨基酸序列测定主要根据Sanger实验室提出的方法进行，一般策略可包括如下步骤。

(1)测定蛋白质中多肽链的数目。根据蛋白质N-末端或C-

末端残基的物质的量和蛋白质的相对分子质量可确定蛋白质分子中的多肽链数目。

(2)拆分蛋白质分子中的多条肽链。以非共价方式相互缔合的寡聚蛋白质中的多肽链(亚基),可用变性剂如8mol/L尿素、6mol/L盐酸胍或高浓度盐处理，拆开亚基。

(3)断裂肽链内部的二硫键。在测定肽链的氨基酸组成之前必须断开一条肽链内半胱氨酸残基之间的S-S桥。

(4)测定每一肽链的氨基酸组成。分离、纯化得到的多肽链样品的一部分用于完全水解以测定其氨基酸组成，计算各种氨基酸的分子比或各种残基的数目。

(5)鉴定肽链的N-末端和C-

末端残基。将得到的多肽链样品的另一部分用于末端残基鉴定以建立两个重要的氨基酸序列参考点。

(6)断开肽链成较小的肽段。分别运用两种或多种不同的断裂方法，将每条肽链样品裂解为断裂点不同的两套或多套重叠的肽段。分离、纯化每套肽段后，测定肽段的氨基酸组成、鉴定肽段的末端残基。

(7)测定各肽段的氨基酸序列。目前常用Edman降解法对肽段测序，并有自动序列分析仪。

(8)拼凑读出肽链的一级结构。利用一条肽链的两套或多套肽段的氨基酸序列彼此间的交错重叠拼接出原来完整肽链的氨基酸序列。确定半胱氨酸残基之间的二硫键位置。

蛋白质分离纯化的方法有哪些?简单说明其原理。

答：对蛋白质分离纯化的方法，是根据蛋白质在溶液中的性质、分子大小、溶解度、电荷、吸附性质和对配体分子的生物学亲和力等确定分离纯化蛋白质的方法。

(1)根据溶解度不同的分离方法

①盐析：在蛋白质溶液中加入大量中性盐，以破坏蛋白质的胶体性质，使蛋白质从溶液中沉淀析出，称为盐析。常用的中性盐有：硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等。盐析时，溶液的pH在蛋白质的等电点处效果最好。

②等电点沉淀：沉淀出来的蛋白质保持天然构象，能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。

③有机溶剂分级分离：凡能与水以任意比例混合的有机溶剂，如乙醇、甲醇、丙酮等，均可引起蛋白质沉淀。

④温度影响蛋白质溶解。

(2)根据电荷不同的分离方法

①电泳：蛋白质分子在高于或低于其pI的溶液中带净的负或正电荷，因此在电场中可以移动。电泳迁移率的大小主要取决于蛋白质分子所带电荷量以及分子大小。

②离子交换层析：一种用离子交换树脂作支持剂的层析法。

(3)根据相对分子质量不同的分析方法

①透析和超滤：透析是利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法；超滤法是应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。

②密度梯度(区带)离心：利用物质密度的不同，经超速离心后，分布于不同的液层而分离。超速离心也可用来测定蛋白质的分子量，蛋白质的分子量与其沉降系数S成正比。

③凝胶过滤，又称分子筛层析，是一种柱层析。

(4)根据对配体的特异生物学亲和力不同的分离方法：亲和层析。

亲和层析是根据蛋白质能与特异的配体相结合而设计的方法，例如抗原与抗体、激素和受体、酶与底物、酶与抑制剂等都能特异结合，这种特异结合是非共价可逆结合，首先形成蛋白质配体复合物，然后通过改变溶液的pH、离子强度等使复合物解离,将被