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1
植物源性产品物种鉴别基因条码技术Sanger测序法
1范围
本文件规定了基因条码技术Sanger测序法的原理、主要试剂、主要仪器设备、样品采集与制备、检
验步骤、质量控制、结果判定与表述、检验过程中防止交叉感染的措施。
本文件适用于植物源性食品、农产品、化妆品、中药材等产品的植物物种定性检测。
注1:物种参见资料性附录A。
注2:方法的检出限为10%(质量比)。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本
文件。
下列文件对于本文件的应用是必不可少的,凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件,其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T19495.3-2004转基因产品检测核酸提取纯化方法
GB/T27403-2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测
SN/T3500进出口食品安全生物学检测抽样规范
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
基因条码DNAbarcode
指生物体一段公认的能够代表该物种的标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。
2
3.2
Sanger测序法Sangersequencing
用于基因测序的双脱氧链末端终止法,在链延伸过程中利用荧光标记双脱氧碱基随机阻断,产生以
A、
T、C、G结束的四组不同长度的核苷酸链,通过读取荧光信号实现对核酸碱基序列信息的读取。
3.3
基因条码技术DNAbarcoding
采用基因测序技术对物种的基因条码进行识别,利用其种内特异性和种间多样性实现对物种的快
速鉴定的技术。
3.4
质量评分Qualityvalue(QV)
仪器测序过程中,软件分析测序信号时,根据预测到的碱基解读错误率,给出针对每个碱基所对应
的质量评分,用以评估单个碱基的测序质量。
4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
BOLD:生命条形码数据系统(TheBarcodeofLifeDataSystem)
bp:碱基对(Basepair)
CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(Cetyltrithylammoniumbromide)
DNA:脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleicacid)
dNTP:脱氧核糖核苷三磷酸(Deoxyribonucleosidetriphosphate)
ddNTP:双脱氧核糖核苷三磷酸(Dideoxyribonucleosidetriphosphate)
EDTA:乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraaceticacid)
NCBI:美国国立生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)
TaqDNA聚合酶:耐热DNA聚合酶(TaqDNApolymerase)
Tris:三(羟甲基)氨基甲烷[Tris(hydroxymethyl)aminomethane]
3
5原理
基于基因条码技术,根据样品类型选择基因条码引物,扩增基因条码序列并双向测序,在数据库中
对序列进行比对,确定物种。
6主要试剂
除另有规定外,所有试剂均为分析纯。实验用水符合GB/T6682中二级水的要求。
6.1TaqDNA聚合酶。
6.2胶回收试剂盒。
6.3分子量标准品(最小片段≥20bp,最大片段≤2000bp)。
6.4琼脂糖。
6.5溴化乙锭。
6.6三氯甲烷。
6.7异丙醇。
6.8无水乙醇。
6.9dNTP混合液(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)。
6.1010×PCR缓冲液。
6.11无菌双蒸水。
6.1270%乙醇。
6.131.2mol/LNaCl溶液。
6.1420mg/mL蛋白酶K溶液。
6.1510×电泳缓冲液:Tris54g/L,硼酸27.5g/L,10mmol/LEDTA,pH8.0。
6.16CTAB提取液:20.00g/LCTAB,81.9g/LNaCl,12.1g/LTris,7.50g/LNa2EDTA,pH8.0。
6.17CTAB沉淀液:5.00g/LCTAB,2.50g/LNaCl,pH8.0。
7主要仪器设备
7.1PCR仪。
4
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