早期肺腺癌患者肺部微生物特征分析.pdfVIP

早期肺腺癌患者肺部微生物特征分析

【摘要】目的分析早期肺腺癌局部微生物存在及变化情况，探究肺部微生物对早期肺腺

癌的发生发展的影响。方法收集中日友好医院确诊为肺腺癌的32例患者肿瘤组织和肺

泡灌洗液，使用Nextseq550DX进行DNA测序，采用R语言计算不同分期分级肿瘤组织及肺

泡灌洗液两种样本中微生物数目、种类及多样性，并使用TSEA和LEfSe分析等统计学方法

比较不同组别的微生物多样性和差异性。结果肺腺癌患者肿瘤组织与肺泡灌洗液两种样

本中放线菌门和变形菌门均占比较高；肿瘤组织检出微生物数目多于灌洗液，且α多样性更

高，但差异不显著(P0.05)。根据不同病理分级患者肺部微生物差异分析：两种样本中浸润

性腺癌相比原位癌＋微浸润癌微生物数目多，且灌洗液α多样性显著增高，组间比较差异有

统计学意义(P0.011);β多样性差异无统计学意义(P0.05)。根据不同病理类型分组分析：

浸润性腺癌组样本而变形菌门减少，原位癌＋微浸润癌组主要由变形菌门组成，各组分析得

到的肺癌差异相关微生物大多属于变形菌门和放线菌门。结论肺腺癌肿瘤组织及灌洗液

中微生物大多属于放线菌门和变形菌门，不同分类下肺癌差异相关微生物大多也属于变形菌

门和放线菌门，是早期肺腺癌患者肺部微生物组成的主要特征。

【关键词】肺腺癌微生物肺泡灌洗液

人体内存在的微生物数量庞大，微生物的稳态与宿主的健康状态息息相关[1]。肺部微

生态与呼吸系统疾病之间存在密切关联，目前的研究主要集中于肺部微生态与慢性气管疾病

[2-4],但近些年来，越来越多的证据表明肺部微生物群与肺癌之间也存在密切关联[5-7]。

通常情况下体内的微生物菌群可维护人体的健康平衡，但一旦某些因素的作用下出现生态失

调，就可能会影响局部微环境，进而影响正常的细胞代谢，导致恶性肿瘤的发生[8-9]。这

种微生态紊乱可能导致炎症、免疫系统异常和改变多种细胞信号通路调节肿瘤转移，从而影

响肺癌的发生和发展[10-11]。

目前关于肺部微生物菌群与肺癌发生之间的研究仍处于探索阶段，主要聚焦于微生物与

不同病理类型肺癌之间相关性、微生物与中晚期肺癌之间的相关性研究。然而针对于早期肺

腺癌发生发展与微生物之间的相关性研究报道相对较少，本研究旨在探索早期肺腺癌患者肺

部微生物存在及变化情况，探究肺部微生物对早期肺癌的发生及进展是否存在影响，为早期

肺腺癌的预防和治疗提供新思路。

资料和方法

选取中日友好医院病理诊断为肺腺癌的32例住院患者的64例样本。其中男14例，女

18例，年龄(57.07±11.8)岁。肺部基础疾病3例，吸烟史6例。

取材部位为肿瘤组织和肺泡灌洗液。纳入标准：(1)无手术禁忌证；(2)胸部高分辨CT

提示早期肺癌可能；(3)经组织病理学诊断为肺腺癌。排除标准：(1)切取肺组织过程中未按

照无菌操作或被污染的标本；(2)病理确诊为非肺腺癌；(3)术前接受新辅助治疗。本研究已

通过中日友好医院伦理委员会批准(2023-KY-151)。

肿瘤组织DNA提取：取黄豆大小一块肿瘤组织，置于离心管中，加入DTT与蛋白酶K,

置于恒温金属浴中，56℃进行消化，使组织中细胞分散，加入差异化裂解试剂之后，释放人

源核酸。离心管中加入核酸酶，消化人源核酸之后，离心管置于恒温金属浴，65℃灭活核酸

酶。将微生物转移到裂解管中，加入氧化锆珠，裂解管置于均质仪中均质30min,裂解样本

中的细菌和真菌。裂解之后提取微生物核酸用于后续实验。

肺泡灌洗液DNA提取：每个样本取2ml肺泡灌洗液置于离心管中。加入差异化裂解试剂

之后，释放人源核酸。离心管中加入核酸酶，37℃室温孵育30min。消化人源核酸之后，离

心管置于恒温金属浴，65℃孵育10min,灭活核酸酶。与氧化锆珠混合，置于新的离心管中，

离心管置于均质仪（上海净信，中国）进行研磨，均质条件为60Hz、30min。使用35μl

洗脱液进行洗脱。提取到的DNA使用Qubit®4.0Fluorometer进行质检。阴性质控亦用

相同的流程进行操作。

DNA文库制备与测序：提取到的DNA,使用Covaris超声打断仪将gDNA打断为200bp左

右的片段。对片段进行末修加A,随后将得到的片段与含有barcode的接头进行连接，随后

进行PCR扩增。构建好的文库使用Agilent2100对文库进行质检并使用Qubit4.0进行

浓度测定。文库被加载到测序芯