第六章负染色技术newCppt课件.pptxVIP

第六章

负染色技术;第六章负染色技术;样品;1.优点：

⑴提高了样品的分辨率和反差高。

分辨率取决于染色剂颗粒的大小，颗粒直径

约D=7?时，?＝10～15?，最高?＝5～7?。

⑵常用、简易、快速、不要求高纯度的样品

制备技术，且用量少

⑶不改变生物活性，即不因染色造成样品变

形。;2.缺点：

⑴负染原理不清楚，结果不稳定，规律

性、重复性差。

(操作时，因样品的种类、染色液浓

度、pH值变化常难以掌握。)

⑵负染色技术只能观察样品表面形貌，

内部结构看不清楚。;三、应用

1、按研究样品分:

观察和研究细菌、原生动物、生物大

分子、亚细胞碎片、分离的细胞器、

蛋白质晶体、病毒病原物

2、按研究方向分:

免疫学、细胞化学;六、负染色剂

1、对染色剂的要求：

⑴、高电子密度，电子散射能力强

⑵、熔点高，电子照射不升华

⑶、溶解度大，不析出沉淀

⑷、本身无结构，与样品不发生化

学反应

⑸、分子小，易于渗透到不规则表

面的凹陷处。;2、常用的染色剂

⑴磷钨酸类

KPT，NaPT，PTA

优点：

适于大多数样品,,颗粒细腻,反差

好,图像背景干净、杂质少

常用1～5％溶液，pH＝6.8～7.4

缺点：

显示样品的结构细节较差，对某些

病毒易产生破坏作用。;⑵醋酸铀（醋酸双氧铀）

UO2(CH2COO)22H2O

pH＝4.0～5.2，0.5～4％水溶液

优点：

显示病毒细节好，反差强，对

样品破坏小

缺点：

颗粒性杂质多，当pH6.0产生

沉淀而失效，见光分解;⑶甲酸铀：

0.5～1%水溶液，pH=4.0-5.2,不稳定，

现配现用

⑷钼酸铵：

1～3％水溶液或醋酸铵溶液，pH=4.0～

9.0

反差小，性能稳定，适于有界膜的

生物样品

⑸硅钨酸：

1～2％，中性偏碱下使用;1.滴染法:(悬滴法)

低浓度的病毒样品可获得较好效果

滴样→滴染液→漂洗;2.喷雾法

优点：样品在膜上分布均匀，雾滴小

缺点：操作繁琐，样品用量大，混合时易产生沉淀。

;3.漂浮法：

①沾样

②吸取多余液体

③滴染液;理想的负染色样品图象：

均匀,没有边缘效应,反差良好,柔和

１、样品纯度：适当提纯，杂质不宜太

多，特别不应有过多的糖类

２、样品浓度适宜：

高浓度：样品堆积、重叠

低浓度：寻找困难

３、样品分布均匀

A、使用分散剂：

B、亲水处理：;4、样品悬液和染液pH的问题

pH＝6.7～7.2

5、染色的时机

不干不湿，存放时间不宜太长

6、用双蒸水充分漂洗

7、观察时用小孔径的光阑，提高反差

;番茄黑环病毒;病毒荚膜：未处理;病毒荚膜：负染色;病毒荚膜：旋转投影;病毒荚膜：金属投影;人类腺病毒在人胚肾细胞核内的晶格排列;腺

病

毒

负

染

色;粘液病毒－－流感病毒;/upload/html/2003042818412/feidian3.htm;1968年，Almeida等对这些病毒进行了形态学研究，电子显微镜观察发现这些病毒的包膜上有形状类似日冕的棘突，故提出命名这类病毒为冠状病毒。1975年国家病毒命名委员会正式命名了冠状病毒科。根据病毒的血清学特点和核苷酸序列的差异，目前冠状病毒分为冠状病毒和环曲病毒两个属。?;作业