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玫瑰花环抑制实验检测肉牛早孕因子(EPF)活性

贺加双;马卫明;邓立新;宋移福;刘莲莲;曹永芝;谢冰

【摘要】[目的]为了根据早孕因子活性的检测作为依据来判断肉牛妊娠状态.[方法]

本实验采集不同孕期的肉牛的血样,同时进行了妊娠诊断,通过玫瑰花环抑制实验检

测活性.[结果]实验表明,未怀孕牛和怀孕牛花环抑制滴度差异显著(P0.05),不同孕

期的早孕因子活性差异不显著.[结论]玫瑰花环抑制滴度高于8可以确认牛怀孕,低

于4为未怀孕.

【期刊名称】《中国牛业科学》

【年(卷),期】2011(037)003

【总页数】3页(P11-13)

【关键词】肉牛;早孕因子;玫瑰花环抑制;EPF

【作者】贺加双;马卫明;邓立新;宋移福;刘莲莲;曹永芝;谢冰

【作者单位】山东农业大学动物科技学院,山东,泰安,271018;山东农业大学动物科

技学院,山东,泰安,271018;河南农业大学牧医工程学院,河南,郑州,450002;山东农业

大学动物科技学院,山东,泰安,271018;山东农业大学动物科技学院,山东,泰

安,271018;山东农业大学动物科技学院,山东,泰安,271018;山东农业大学动物科技

学院,山东,泰安,271018

【正文语种】中文

【中图分类】S814.1

早孕因子是哺乳动物受精后最早在血清中检测到的具有免疫抑制和生长调节作用的

妊娠相关蛋白。它是一种免疫抑制因子和生长因子,1974年由澳大利亚学者

Morton等[1]在孕鼠血清中首次发现,由于在小鼠受精6h后就可检测到,因此被命

名为早孕因子。此后,在妊娠妇女[2]、羊[3]、猪[4]、牛[5]等妊娠哺乳动物母体内

相继检测到了EPF。目前普遍认为EPF是热激蛋白家族成员—伴侣蛋白10(Cpn-

10)的同系物[6,7],是最早确认妊娠的生化标志之一,是防止母体对胚胎乃至胎儿发

生免疫排斥反应的必需物质[8]。由于它能增强抗淋巴细胞血清抑制T淋巴细胞花

环形成,可用花环抑制试验做生物学鉴定。在牛授精后尽早对其做妊娠诊断可以避

免空怀,胚胎死亡后早孕因子会迅速下降,因此监测早孕因子活性对肉牛产业意义重

大,由于早孕因子在超早期妊娠诊断,肿瘤病的诊断,胚胎监测,治疗实验性自身免疫性

脑脊髓膜炎[9,10],流产预测等方面具有潜在的应用价值,因此成为研究的重点。

1材料与方法

1.1血样的采集与处理

肉牛血样采自山东省鄄城县鲁西黄牛保种繁殖基地。颈静脉采血取11头不同孕期

孕牛(孕期1～2月5头,3～5月4头,6～9月2头)和4头未怀孕肉牛血液做对照。

该15头牛体重相当,营养状况和饲喂条件均一致。2500r/min离心20min,分离

血清,并在56℃下钝化30min,分装,-20℃保存备用。采样时已做妊娠诊断。

1.2牛外周血淋巴细胞悬液的制备

采集健康肉牛血液,0.1%肝素钠抗凝。加入等体积pH7.4的PBS液,混匀,按每管4

mL轻轻叠加于盛有等量牛淋巴细胞分离液(D=1.086)的10mL离心管中。2000

r/min离心15min。离心结束后,吸取分离液与血浆交界部位的灰白云雾层,用3倍

体积的PBS液以2500r/min离心20min。弃上清,沉淀洗涤2次,取l滴细胞悬

液,用台盼兰拒染法镜检计数细胞,最后将细胞调整到2×106个/mL,备用,并3h内

使用。

1.3绵羊红细胞(SRBC)的制备

绵羊颈静脉采血,0.1%肝素钠抗凝,2500r/min离心15min分离红细胞。用PBS

液洗5次,配成终浓度为1.5%。4℃保存备用。

1.4玫瑰花环形成率检测

孕牛血清倍比稀释成终体积为100μL。加等体积的淋巴细胞,37℃孵育60min,加

100μL1.5%的绵羊红细胞,37℃孵育5min,2000r/min离心2min,室温孵育40

min,轻轻重悬,20μL10%的戊二醛固定,涂片,瑞氏染色,镜检。计数淋巴细胞和红

细胞形成的花环结构。结合红细胞少于3个的不计入。花环抑制滴度(RIT值)按花

环数低于对照组75%的最高血清稀释倍数的对数计算。

1.5数据分析

数据分析采用SPSS。

2结果

2.1玫瑰花环抑制滴度

怀孕1～9月肉牛玫瑰花环抑制滴度是8～10,而对照组花环滴度为3,显著高于对照

组,因此按此法做玫瑰花环抑制试验检测肉牛的早孕因子活性,可以认为滴度高于8

为怀孕状态