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猪流行性腹泻病毒血清学与抑制病毒入侵细胞的研究

猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV)是急性、高度

传染性猪流行性腹泻(Porcineepidemicdiarrhea,PED)的致病原,可感染所有日

龄的猪,并在哺乳仔猪中引起较高的死亡率。本研究主要对PEDV编码的结构或非

结构蛋白进行表达纯化,并以此为检测抗原建立敏感有效的血清学检测方法,对

感染或免疫PEDV后不同日龄猪体内的抗体消长规律进行监测;同时以制备的抗

PEDV的单抗为基础,对PEDV入侵机制进行初步研究。

根据PEDVG2毒株(GenBankaccessionno.KU558701)基因序列设计特异性

引物,以其cDNA为模板分别扩增PEDVS1、E、ORF3C、非结构蛋白nsp1、nsp2以

及nsp3中Ac(Acidicdomain)、ADRP(ADP-ribose-1-monophosphatasedomain)

功能域,克隆到真核或原核表达载体中,构建重组表达质粒,利用真核或原核表达

系统表达相应蛋白,并进行层析纯化,经SDS检测、Westernblot鉴定正确

后,作为免疫原,免疫新西兰大白兔,制备相应的兔抗PEDV多克隆抗体;Western

blot和IFA鉴定获得的抗体有较好的反应性和特异性,ELISA检测其效价均达到

1:100000以上,可满足后期试验需要。用PEDVG2毒株感染Vero细胞,扩增病毒。

蔗糖密度梯度离心纯化PEDV细胞毒,制备纯化的PEDV全病毒颗粒;同时分别

以前期制备的PEDVS1蛋白、ORF3C蛋白和E蛋白作为检测抗原,方阵滴定法确定

PEDV纯化全病毒颗粒、S1蛋白、ORF3C蛋白和E蛋白的最佳抗原包被浓度分别

是5μg/mL、4.4ng/mL、15.6ng/mL、7.8ng/mL;最佳一抗稀释度均为1:100,

最佳二抗稀释度为1:10000;并对抗原包被条件、抗体作用时间、孵育温度等条

件进行优化,最终分别建立以PEDV全病毒和S1蛋白为抗原的间接ELISA方法检

测临床样本中抗PEDVIgG和IgA抗体,以PEDVORF3C和E蛋白为抗原的间接

ELISA方法检测样本中抗PEDVIgG抗体。用上述方法检测国内不同猪场中有腹泻

症状的不同年龄段的猪初乳、奶、血清、粪便等不同样本中抗PEDV抗体的存在

情况;结果显示,所检样本中普遍存在抗PEDV抗体;相比之下,母猪中抗PEDV抗体

水平较高,0-1W龄中也存在较高水平的抗PEDV抗体,但在3W龄猪中抗体水平开

始下降,7W龄时抗体水平有所上升,13W和20W龄时抗体水平基本不变;这与当前

不同年龄段猪感染PEDV的情况基本相符。

同时,本研究对部分猪血清中抗PEDV中和抗体进行随机抽检,结果表明,抗

PEDV抗体水平高的样本中的中和抗体水平也较高,即本研究所建立的ELISA检测

方法与中和试验检测结果基本一致,有较高的可信度。用上述间接ELISA方法和

Westernblot、IFA(Immunofluorescence)检测PEDV全病毒颗粒、PEDVS1、ORF3、

E及nsp1、nsp2、nsp3-Ac和nsp3-ADRP蛋白与临床PEDV感染猪血清样品中抗

PEDV抗体的反应性.结果显示,虽然S1和Ac蛋白在IFA检测中均出现特异性荧

光,但在Westernblot检测中,S1蛋白的敏感度和特异性更高。

对951份感染状态未知的猪血清的ELISA检测结果显示,上述PEDV蛋白均有

一定反应性。而PEDVS1、ORF3C、E蛋白和PEDV全病毒纯化抗原检测均显示出

相似的抗体消长趋势,且抗PEDVIgG抗体均在1周龄仔猪中最早出现。

同时,对30份未感染PEDV的仔猪阴性血清检测显示,上述所有蛋白作为检测

抗原均未出现反应;即本研究制备的检测抗原均有高度特异性。综上所述,PEDVS1

蛋白可作为PEDV感染检测的最佳血清学诊断抗原。

用PEDVS1蛋白为免疫原,免疫6-8周龄BABL/C小鼠,按照传统杂交瘤细胞

技术制备抗PEDVS1单克隆抗体;最终获得4株稳定分泌抗PEDVS1蛋白的单克隆

抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2C2G