现代微生物生态学.ppt

3）通过16SrRNA种属特异性的探针与PCR产物杂交以获得微生物组成信息。此外，探针也可以直接与样品进行原位杂交，通过原位杂交不仅可以测定微生物丰度，且能分析它们的空间分布16SrRNA基因片段的分析方法特点：简单快速。主要应用：快速验证其它方法可能出现的假阴阳性；混合物中钓取已知特定种类。4）对PCR产物进行RFLP或T-RFLP。将PCR产物酶切，通过观察酶切电泳图谱、数值分析，确定微生物基因的核糖体型，再同核糖体数据库中的已有数据进行比较分析。主要应用：微生物组成和不同微生物的种属关系分析。?第32页,共46页，星期六，2024年，5月样品的采集土壤和污泥样品的采集一般不要求无菌操作。而应当注意样品的深度。水体样品的采集，应视水体清洁程度而定，或直接采集或用滤纸过滤浓缩（要求容器和过滤器无菌及无菌操作）空气样品的采集：要求在无菌操作下进行滤纸过滤生物体上的样品采集，要求取下一定量的组织，用无菌溶液把其中的微生物洗涤下来。第33页,共46页，星期六，2024年，5月富集培养和菌种分离用一定的选择性培养基进行培养，把样品中所含的特殊微生物数量得到提高。一般进行2~3次富集培养分离通常还是采用与富集相同的培养基进行划线分离挑取单菌落再进行2~3次的纯化。第34页,共46页，星期六，2024年，5月最大或然值法（MPN）适用于测定在一个混杂的微生物群落中虽不占优势，但却具有特殊生理功能的类群。菌液经多次10倍稀释后，然后每个稀释度取3—5次重复接种于适宜的液体培养基中。培养后，将有菌液生长的最后3个稀释度（即临界级数）中出现细菌生长的管数作为数量指标，由最大或然数表上查出近似值，再乘以数量指标第一位数的稀释倍数，即为原菌液中的含菌数。应注意两点：菌液稀释度选择要合适，原则是最低稀释度的所有重复都应有菌生长，而最高稀释度的所有重复无菌生长。?每个接种稀释度必须有重复，重复次数可根据需要和条件而定，一般3—5个重复。第35页,共46页，星期六，2024年，5月例1：如某一细菌在稀释法中的生长情况如下；???稀释度?????????10-3???10-4???10-5???l0-6???10-7??10-8???重复数??????????5?????5?????5?????5?????5????5???出现生长的管数??5????5?????5?????4?????1????0其数量指标为“541”，查最大或然数表得近似值17，然后乘以第一位数的稀释倍数即每毫升原菌液含活菌数为l700000个。确定数量指标：不管重复次数如何，都是3位数字，第一位数字必须是所有试管都生长微生物的某一稀释度的培养试管，后两位数字依次为以下两个稀释度的生长管数，如果再往下的稀释仍有生长管数，则可此数加到前面相邻的第三位数上即可。例2：如某一微生物生理群稀释培养记录为：???稀释度??????????l0-1?????10-2????10-3????l0-4????10-5????10-6???重复数???????????4??????4??????4?????4??????4?????4???出现生长的管数???4??????4??????3?????2??????1??????0数量指标为“433”，查表得近似值为30，则每毫升原菌液中含活菌30×102个。第36页,共46页，星期六，2024年，5月附表23-1几种主要微生物生理群MPN计数法一览表微生物生理群培养基常用稀释度常用重复次数培养时间(天)主要检查方法氨化细菌蛋白胨氨化培养基0-6—10-947根据培养液加奈氏试剂后是否出现棕色或褐色，确定是否产生氨。亚硝酸细菌铵盐培养基0-2—10-7314根据培养液加格利斯试剂Ⅰ及Ⅱ的反应，出现绛红色证明有NO-2生成；或在培养中加锌碘淀粉试剂及体积比值为20%的H2SO4，若出现蓝色，证明有NO-3生成。硝酸细菌亚硝酸盐培养基0-2—10-6314根据培养液加入浓硫酸及二苯胺试剂后，是否出现蓝色，确定是否有NO-3生成。反硝化细菌反硝化细菌培养基0-4—10-8314根据杜氏小管有无气体，确定有无N2生成；利用格利斯试剂Ⅰ及Ⅱ和二苯胺试剂、浓硫酸检测有无NO-2生成及有无N