临床PCR试剂盒选用和质检.pptVIP

020304050601实验室设施、工作区域、能源、照明等；本章包括五条；环境和实验条件控制设施：温湿度计、不间断或稳压电源等；废弃血清处理、生物防护等措施和相应设施实验室进出的限制和控制：人员进入控制标识、生物传染危险性标识实验室“内务管理”（如人员流动、清洁等）制度和相应设施；设施和环境清洁用具的专用、清洁工作的单一流向、清洁方法的具体性清洁程序或制度对工作人员的保护和对环境的保护锐器使用规则生物传染危险性废弃物出实验室前预处理生物防护及废弃血清处理设施和环境需注意的问题临床PCR试剂盒的选用和质检卫生部临床检验中心李金明PCR或RT-PCR试剂盒的组成核酸提取试剂核酸扩增或逆转录-核酸扩增试剂产物检测试剂（有些使用全自动分析仪的PCR方法因其核酸扩增和检测同时完成，故无专门的产物检测试剂）影响PCR试剂盒质量的因素内在因素:原材料、核酸提取方法、方法学设计AEDBC扩增所需的原材料寡核苷酸引物和探针聚合酶、逆转录酶等缓冲液和dNTP影响PCR试剂盒质量的因素：PCR反应混合物Mg2+Mn2+dCTPdGTPdUTPdATPTaqDNA多聚酶rTthDNA多聚酶AmpErase生物素标记的引物和或和其对试剂盒质量的影响首先是纯度。纯度的判断可根据260/280吸光度比值来判断，如?2.0，则需重新纯化。另一种方法是将其在聚丙烯酰胺凝胶上电泳，如出现一条以上的带或迁移位置错误，则需重新纯化。12结合特异性（浓度）3是否有污染。寡核苷酸引物和探针dNTP（包括dATP、dCTP、dGTP和dTTP或dUTP）的浓度01缓冲液：在储存和扩增循环中稳定、作为聚合酶活性所必须的Mg＋＋（或用于rTth的Mn＋＋）的浓度以及pH等02dNTP和缓冲液酶的浓度01酶的活性02逆转录酶、DNA聚合酶核酸扩增方法PCRRT－PCR转录依赖的扩增（TMA）连接酶链反应（LCR）链替代扩增（SDA）等核酸提取的有效性核酸提取的简便性影响PCR试剂盒质量的因素：

核酸提取杂交固相特异探针及其标记物影响PCR试剂盒质量的因素：产物检测影响PCR试剂盒质量的因素1内在因素:原材料、核酸提取方法、方法学设计外在因素：试剂盒的运输和贮存外在因素：试剂盒的运输和贮存2PCR试剂盒的有效期一般为6个月，这是指在适当的贮存温度下。核酸扩增部分的试剂一般要贮存于-20℃下；产物检测部分试剂则贮存于2～8℃。试剂盒从厂家到用户手中，均要经历运输及运输中的贮存，任一环节的不当，均会影响试剂盒的临床使用质量。试剂盒的运输和贮存STEP1STEP2定性测定：PCR-ELISA、PCR-膜上杂交（杂交梳）、荧光PCR（分子信标和TaqMan等）定量测定：PCR-ELISA、TaqMan和Amplisensor荧光定量、AmplicorPCR-ELISA定量等。PCR试剂盒的分类2017参考试剂生产厂家的信息广告012018参考同行对有关试剂盒的使用效果022019参考有关机构的综合评价032020根据使用目的042021根据所在实验室的技术特点052022根据所在医院患者的承受能力06PCR试剂盒的选用原则外包装：厂家名称、检测目的、批准文号、批号和有效期等。01内包装：试剂瓶是否漏液、真空包装是否破损以、试剂是否齐全以及是否有使用说明书等。02PCR试剂盒的质检性能质检采用血清（样本）盘（Panel）质检：PCR试剂血清（样本）盘由一定数量的原血清阴、阳性样本、2～3份纯化核酸（DNA或RNA或cDNA）样本以及3～5份系列稀释阳性样本所组成。样本总数可定在20份左右。原血清样本用于判断试剂盒对特定病原体核酸检出的特异性、灵敏度和符合率；纯化核酸样本用于判断DNA扩增或逆转录及DNA扩增的有效性；系列稀释阳性样本用于判断试剂的测定下限。010302PCR试剂盒的质检(定性测定)试剂特异性、灵敏度和符合率计算公式试剂特异性、灵敏度和符合率计算公式01灵敏度（％）＝(a/a+c)?100%03符合率（％）＝(a+d/a+b+c+d)?100%02特异性（％）＝(d/b+d)?100%样本：已知浓度的高