HPLC的使用操作和需要注意的事项 .pdfVIP

HPLC（高效液相色谱法）使用操作和注意事项

HPLC的流程简图：

流程

流程：如右图所示，溶剂贮器（1）中的流动相被泵（2）吸入，经〔3〕梯度控制器

按一写的梯度进行混后然后输出，经（4）测其压力和流量，导入（5进样阀（器）

经（6）保护柱、（7）分离柱后到（8）检测器检测，由（10）数据处理设备处理数

据或（11）记录仪记录色谱图，（12）馏分收集器收集馏分，（13）为废液。.

一．操作步骤

1．排空状态：将吸液头让在已经超声的甲醇中，旋松排空阀让机器以高流速排

走机器或输液管的气泡，3—5分钟后关闭排空阀，排空结束。

2．冲洗状态：以适当流速冲洗机器核色谱柱大约20分钟;同时开启检测器，让

检测器处于预热和自检状态。

3．联机状态：打开联机电脑让色谱工作站和HPLC机器相连设定吸收波长，适当

流速，查看系统压力是否正常。

4．用已经配好的流动相换下甲醇开始走基线，此过程大约20分钟

5．当基线平稳，开始进样准备。

6．进样前用进样液清洗六通阀2-3次。

7．样品打入机器开始谱图。

8．谱图完成清洗机器和关闭电脑：用甲醇做流动相以适当流速开始冲洗机器大

约15分钟，确定甲醇已经充满机器管道。同时用甲醇清洗六通阀若干次。退

出色谱工作站和关闭电脑。

9．整理数据填写结果。

二．注意事项

1、进样前样品处理及注意事项

（1）须用专用平头液相专用注射器进样（禁用气相尖头进样针）；

（2）进样试液应无颗粒、浑浊和乳化，使用前先用超声波溶解后，须用0.45um的过滤膜

过滤；

（3）部分装取样时，取样体积一般小于定管的50%，完全装液相取样体积取必须是定量环

的5倍以上

2、操作中注意事项：

1)．流动相均需色谱纯度，水用20M的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起

气泡。

2)柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。

3）所有过柱子的液体均需严格的过滤。

4)压力不能太大，最好不要超过150kgf/cm2.

5)因为缓冲试剂遇有机溶剂，会结晶，有损色谱柱，所以，每次由有机相变流

动相或流动相变有机相均需用蒸馏水清洗。

6）温度是影响HPLC的压力重要原因之一，所以尽量保持恒温。