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基因工程常见问题梳理

1、什么是星星活性，产生的原因及解决方案？

星星活性是指在极端非标准条件下，限制性内切酶能切割与识别序列相似的序列，而造成

误切的现象。

产生的原因：

1)甘油浓度过高，大于5%；

2)酶过量，100U/ul；

3)Mg2+被其他的二价金属离子取代；

4)pH过高，8.0；

5)添加了有机溶剂DMSO、乙醇等；

6)离子强度低，25mmol/l。

2、限制性内切酶的发现、分类和各类的特点：

限制性内切酶的发现是20世纪60年代，噬菌体侵染大肠杆菌之后，DNA在感染宿主

中会被降解，从而提出了限制酶切和限制酶的概念。1970年，H.Smith偶然发现了HindIII，

揭开了限制酶的面纱。

主要分为三类：

I类、III类：限制作用需要ATP

II类：最常使用的一类限制酶，识别序列主要有4-6个核苷酸，回文结构，与甲基化的

反应分开，限制作用不需要ATP。

3、不同条件的两种限制性内切酶，双酶切时应该采取什么措施？

1)同步双酶切：配置同时适合这两种限制酶的最佳缓冲体系，同时加入两种酶；

2)分步酶切：分开加酶时遵循先低盐后高盐原则，而且可以在加入第二种酶的时

候使第一种酶失活，避免产生星星活性。

3)使用配有特殊缓冲液的酶进行酶切：在大多数情况下采用标准缓冲液的酶也能

在这些特殊缓冲液中进行酶切，这保证了对缓冲液有特殊要求的酶也能良好工

作。由于内切酶在非最佳缓冲液中进行酶切时，反应速度会减慢，因此需要增

加酶量，延长反应时间。

4、差异杂交的基本原理和思路

差异杂交要拥有两种不同的细胞群体：在一个细胞群体中的目的基因正常表达，在另一

个细胞群体中的目的基因不表达。在这种情况下便可制备两种不同的mRNA提取物。其一

是含有目的基因的mRNA的总mRNA，另外一种是不含有目的基因mRNA的总mRNA。

因此，可以通过这两种mRNA的cDNA拷贝为探针，对由表达目的基因的细胞总mRNA构

建的克隆库进行筛选。

思路：

将来自一种细胞的mRNA反转录形成cDNA的第一链，用这种细胞的cDNA与另一种

细胞过量表达的mRNA进行杂交。如果在第一种细胞中是特异表达的mRNA，则会产生特

异的cDNA链，不会与第二种细胞的mRNA杂交。通过羟基磷灰石柱层析，洗脱未形成杂

交体的cDNA，它代表第一种细胞中特异表达的基因。以该链为探针，第一种细胞的cDNA

文库的重复拷贝杂交，跟探针能够杂交克隆的是在组织细胞中特异表达的mRNA。再对这

样的克隆进行测序比较，鉴定，就分离得到这种组织特异表达的基因，所有包含重组体的菌

落，阳性反应在X射线上呈现黑色的点。比较这两种底片对照原平板。便可以挑选所有含

有目的基因的菌落，供进一步研究使用。

5、如何检测外源基因

1)外源基因导入基因组中的检测：southern杂交、PCR扩增检测、报告基因检测；

2)外源基因在基因组中转录检测：northern杂交；

3)外源基因在基因组中翻译检测：western杂交；

4)筛选标记基因：如一些抗性基因表达后可在含抗生素的培养基上存活；

5)直接观察基因表达的特殊性状来检测目的基因是否表达。

6、目的基因重组后不表达的原因。

1)导入了特异启动子对该基因的表达无效；

2)启动子与目的基因的距离过长，表达效果降低；

3)由于密码子偏爱性，目的基因含有大量寄主细胞的稀有密码子而造成表达量降低

4)真核基因在原核表达系统中的表达方式不一致；

5)寄主细胞中内源蛋白造成外源蛋白降解，或因为修饰系统不同而使外源蛋白活性降

低或缺失。

7、蓝白斑筛选的原理：

某些质粒带有大肠杆菌lacZ突变体lacZ’基因，当其与另一个lacZ突变体lacZΔM连接

时可实现α-互补，编码β-半乳糖苷酶。如果在lacZ’基因的上游插入一段小的