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为天地立心，为生民立命，为往圣继绝学，为万世开太平。——张载

荧光定量PCR手册

一、什么是荧光定量PCR

荧光定量PCR（QuantitativeRealtimePCR，qPCR）是一种在DNA

扩增反应中，通过荧光信号的实时监测来定量分析特定核酸序列的技

术。简单来说，它能告诉我们样本中特定基因的数量有多少。

这一技术在生物学、医学、农学等众多领域都发挥着重要作用。比

如，在医学诊断中，能检测病毒或细菌的感染量；在基因研究中，可

分析基因的表达水平。

二、荧光定量PCR的原理

荧光定量PCR的原理基于传统的PCR技术，但增加了荧光检测的

环节。

在PCR反应中，DNA会被不断复制。我们会在反应体系中加入一

种特殊的荧光探针或荧光染料。这些荧光物质的荧光强度会随着PCR

反应的进行而发生变化。

当PCR反应开始时，荧光信号很弱。随着反应的进行，DNA不断

扩增，荧光信号逐渐增强。通过检测荧光信号的强度变化，我们就能

实时了解PCR反应的进程，并计算出初始样本中目标DNA的含量。

三、荧光定量PCR的实验流程

（一）样本准备

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首先，需要从待检测的生物样本（如血液、组织、细胞等）中提取

出DNA或RNA。提取的质量和纯度对后续实验结果至关重要。

（二）引物和探针设计

设计合适的引物和探针是关键步骤。引物是一小段能与目标DNA

序列特异性结合的寡核苷酸，它们决定了PCR反应扩增的区域。探针

则用于检测扩增产物，通常带有荧光标记。

（三）PCR反应体系配置

将提取的核酸模板、引物、探针、酶、缓冲液、dNTPs等试剂按照

一定的比例混合，配置成PCR反应体系。

（四）PCR反应

将配置好的反应体系放入荧光定量PCR仪中，设置好反应程序，

进行PCR反应。

（五）数据分析

PCR反应结束后，仪器会给出荧光信号的变化曲线。通过对这些曲

线进行分析，可以得出目标基因的初始含量。

四、荧光定量PCR的关键要素

（一）引物和探针的设计

引物和探针的特异性、长度、GC含量等都会影响PCR反应的效率

和特异性。一般来说，引物长度在18-25个碱基之间，GC含量在40%

－60%之间较为合适。

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（二）反应体系的优化

包括酶的选择、dNTPs的浓度、镁离子浓度等。不同的反应条件可

能会导致不同的实验结果，需要进行优化和验证。

（三）荧光染料和探针的选择

常见的荧光染料有SYBRGreenI，它能与所有的双链DNA结合发

出荧光；而荧光探针如TaqMan探针、MolecularBeacon探针等则具有

更高的特异性。

（四）仪器的选择和使用

荧光定量PCR仪的性能和操作方法也会影响实验结果。需要选择

合适的仪器，并按照操作规程进行操作和维护。

五、荧光定量PCR的应用领域

（一）医学诊断

用于检测病原体（如新冠病毒、乙肝病毒等）的感染，判断疾病的