临床样本的采集运输和保存及核酸提取.pptVIP

四、RNA的分离与纯化

破裂细胞释放核酸01机械法与非机械法02（非机械法中溶胞法是应最广泛的方法）03核酸的释放：（二）、核酸提取的基本步骤各种组织细胞破碎方法细胞破碎方法应用Ⅰ机械法1.匀浆法机体软组织2.捣碎法动物韧性组织3.研磨法细菌、酵母Ⅱ物理法1.超声法细胞混悬液2.反复冻融法培养细胞3.冷热交替法细菌、病毒4.低渗裂解红细胞Ⅲ化学法1.有机溶剂细菌、酵母、血液2.去垢剂组织、培养细胞、血液3.酶解法细菌、酵母、血液01将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其02他物质分离03非核酸的大分子污染物（蛋白质、多糖和脂04类分子）、非需要的核酸分子、试剂和溶液核酸的分离与纯化：核酸的浓缩、沉淀与洗涤01020304沉淀可去除部分杂质与某些盐离子加入一定的盐类（醋酸钠、氯化钠等）后使用有机溶剂（如乙醇、异丙醇等）少数盐类可使用70-75%的乙醇洗涤01核酸的鉴定02浓度鉴定03纯度鉴定04完整性鉴定01紫外分光光度法：测定DNA在A260nm的光吸收值。02如计算DNA浓度03A260×稀释倍数×50＝μg/ml04紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25ug/ml的核酸溶液。05(A值等于1时，相当于50μg/ml双链DNA，40μg/ml单链DNA或RNA，20μg/ml单链寡核苷酸）DNA：浓度鉴定RNA：01紫外吸光光度法:A260×稀释倍数×40＝μg/ml(OD260-OD320)×稀释倍数×40＝μg/ml02荧光光度法适用于低浓度核酸溶液的定量分析（1-5ng）荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。EB与DNA的结合纯度鉴定紫外分光光度法：在260nm和280nm处测定DAN溶液的光吸收，纯的DNAA260与A280之比应在1.80(1.60~1.80)，低于此值表明制备物中留有蛋白质成份。高于此值表明有RNA的残留量纯的RNAA260与A280之比应在2.0(1.80~2.00),Ratio1.8:蛋白质污染;Ratio2.2:RNA可能已经水解成单核苷酸A260/A280比值是纯度检测的重要指标！注：测定吸光值，稀释液应使用ＴＥAB基因组DNA电泳，在电场中泳动慢，如果发生降解，可出现电泳图谱脱尾现象；总RNA电泳，观测各条带的含量，提示是否存在RNA降解；如加样槽中存在条带，可能是DNA污染。凝胶电泳法：完整性鉴定DNA完整性鉴定：RNA完整性鉴定：正常时，28SRNA的荧光强度约为18SRNA的2倍，否则提示RNA的降解短期贮存：4℃或-20℃存放于TE（tris和EDTA）缓冲液中。TE缓冲液的PH与DNA贮存有关，PH为8时，可减少DNA脱氨反应，PH低于7.0时DNA容易变性。长期贮存：TE缓冲液中-70℃保存数年；在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染。0103025、核酸的贮存——DNA保存RNA可溶于0.3mol/L的醋酸钠溶液或双蒸水，在-70℃保存。RNA可溶于70%的乙醇溶液或去离子的甲酰胺溶液中，可在-20℃保存。RNA如果以DEPC（焦碳酸二乙酯）可以抑制RNA酶对RNA的降解030102核酸的贮存——RNA保存：三、基因组DNA的分离与纯化血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等常见的标本：最好新鲜组织，若不能马上提取，应贮存70℃或液氮生物组织：（一）、DNA样品准备DNA提取前样本采集、预处理和保存：全血抗凝剂：EDTA-Na2或枸橼酸钠作为抗凝剂不宜使用肝素抗凝剂处理血肝素柠檬酸*EDTA*-80℃保存2个月，第10天收率90%4℃第四天收率90%第10天提取效果差第十天收率85%室温提取效果差第四天收率90%第十天提取效果差（二）、DNA提取酚抽提法：先用EDTA、SDS、蛋白酶K破碎细胞，消化蛋白，然后用pH8的Tris饱和酚或酚-氯仿抽提DNA，最后乙醇或异丙醇进行沉淀。获DNA大小为100－150kb。酚抽提法提取步骤：DNA酚抽提法示意图01主要试剂的作用：EDTA：1.二价金属螯合剂，抑制核酸酶；降低细胞膜的稳定性020301SDS的作用：溶解膜蛋白和脂肪，从而使细胞膜破裂溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸02释放出来对RNA、DNA酶有抑制作用与蛋白质形成R-