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动物寄生虫病PCR诊断技术

聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction,PCR）技术是一种既敏感又特异的DNA体外扩增

方法，它可将一小段目的DNA扩增上百万倍，其扩增效率使得该方法可检测到单个虫体或

仅部分虫体的微量DNA。通过设计种、株特异的引物，此法只扩增出种、株特异的PCR产

物，具有很高的特异性。而且PCR技术的操作过程也相对简便快捷，无需对病原进行分离

纯化；同时可以克服抗原和抗体持续存在的干扰，直接检测到病原体的DNA，既可用于虫

种、株的鉴别，动物寄生虫病的临床诊断，又可用于动物寄生虫病的分子流行病学调查。随

着PCR技术的不断完善与发展，它已广泛应用于分子生物学、生物技术、临床医学等各个

领域，具有广泛的应用前景。

一、实验目的要求

掌握PCR诊断技术所涉及实验的基本原理，全面熟悉PCR诊断技术的操作过程，其中包括

寄生虫DNA的提取、PCR引物的设计、PCR条件的优化、对目的片断的扩增、琼脂糖凝胶电

泳及结果分析、PCR产物的纯化等等。

二、实验仪器和材料

（一）寄生虫基因组DNA的提取及纯化

1.虫体材料。单个虫体。

2.器具。超净工作台、恒温培养箱、TGL-16G高速台式离心机、旋涡振荡器、微量取液器及

配套吸头、微量离心管、一次性注射器、微型眼科镊、微型眼科剪刀、玻璃平皿、滴管、有

机架等。

3.试剂。

(1)乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraaceticacid，EDTA）、十二烷基磺酸钠（Sodium

dodecylsulfate，SDS）、三（羟甲基）氨基甲烷-盐酸（Tri(Hydroxymethyl)Aminomethane-HCl，

Tris-HCl）、氯化钠、蛋白酶K（25µg/µl）、异丙醇（80%）、双蒸水、灭菌超纯水等。

(2)DNA裂解液：500mMNaCl70µl、100mMTris-HCl（pH8.0）30µl、50mMEDTA（pH8.0）

150µl、10%SDS30µl。

(3)WizardTMDNAClean-Up试剂盒或类似的DNA提取试剂盒。

（二）PCR扩增及琼脂糖电泳

1．材料。提纯的虫体DNA。

2．器具。超净工作台、微型高速台式离心机、微量取液器（2/20/200/1000µl）、PCR扩增

仪、琼脂糖电泳系统、凝胶成像系统、微波炉、4℃/-20℃冰箱、紫外透射仪、微型离心管

（200/500/1500µl）、有机架、一次性手套、透明胶带、量筒（100ml）、三角瓶（500ml）

等。

3．试剂。

(1)10×PCRBuffer（无Mg2+）、dNTP（2.5mMeach）、ddH2O、MgCl2（25mM）、Primers、

ExTaq酶（5U/(l）、琼脂糖、EB（10mg/ml）、Tris碱、硼酸（Boricacid）、去离子水、EDTA

（0.5mol/L，pH8.0）、10×载样缓冲液。

(2)0.5×TBE缓冲液：准确秤取Tris碱5.4g，硼酸2.75g，充分溶解于800ml去离子水中，加

10ml0.5mol/LEDTA（pH8.0），用去离子水定容至1000ml。

（三）PCR扩增产物的纯化

1．材料。PCR扩增产物。

2．器具。TGL-16G高速台式离心机；三用电热恒温水箱；微量取液器（2/20/200/1000µl）、

琼脂糖电泳系统、微波炉、电子天平、4℃/-20℃冰箱、紫外透射仪、微型离心管（500/1500

µl）、有机架、透明胶带、一次性注射器、量筒（100ml）、三角瓶（500ml）、手术刀、保鲜

纸等。

3．试剂。琼脂糖；0.5×TBE缓冲液；UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒；UNIQ-10柱式PCR

产物纯化试剂盒；异丙醇（80%）等。

三、实验方法、步骤和操作要领

(一)寄生虫基因组DNA的提取及纯化

1.实验原理。应根据研究目的来决定是从单个虫体还是多个虫体提取基因组DNA。寄生虫虫

体的各个部位都可以作为基因组DNA的抽提材料，如果虫体较大的话可取其中部而保存其

头部及尾部，以备形态学鉴定以验证其种类。如果虫体较小（小于1cm），则应使用整条虫

体抽取DNA。若虫体特别细小（例如幼虫），可用多条虫体来提取DNA。为了获得高含量、

高纯度的DNA，最好使用新鲜材料。从冻干或50%-70%乙醇保存的寄生虫材