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博观而约取，厚积而薄发。——苏轼
荧光定量pcr检测实验操作步骤
实验方法原理实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光
基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，-后通过标准曲线对未知模
板进行定量分析的方法。
实验材料
细胞样品
试剂、试剂盒
RNA提取试剂盒荧光定量PCRMixTRIZOLdNTP氯-仿逆转录酶MMLV异
丙醇Taq酶DEPC水ddH2OTEMgCl2琼脂糖溴化乙锭MOPS甲醛乙酸钠
EDTAEB溴酚兰
仪器、耗材
离心管离心机风光光度计电泳槽凝胶板RealtimePCR仪
实验步骤
一、样品RNA的抽提
1.取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
2.两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯-仿，
盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12
000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯-仿相，中间层
以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时
加入的TRIZOL试剂的60%。
3.RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异
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博观而约取，厚积而薄发。——苏轼
丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000
rpm离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶
状沉淀块。
4.RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml
的75%乙醇〔75%乙醇用DEPCH2O配制〕，清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000
rpm离心5分钟。
5.RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥
5-10分钟。
6.溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40ul用枪反复吹打
几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
二、RNA质量检测
1.紫外吸收法测定
先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释
〔1:100〕后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶
液浓度和纯度。
〔1〕浓度测定
A260下读值为1表示40ugRNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：
A260x稀释倍数x40ug/ml。具体计算如下：
RNA溶于40ulDEPC水中，取5ul，1:100稀释至495ul的TE中，测
得A260=0.21
RNA浓度=0.21x100x40ug/ml=840ug/ml或0.84ug/ul
取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35ul，剩余RNA总量为：
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博观而约取，厚积而薄发。——苏轼
35ulx0.84ug/ul=29.4ug
〔2〕纯度检测
RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。
2.变性琼脂糖凝胶电泳测定
〔1〕制胶
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