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八、第三代生物传感器1、酶直接电荷传输的困难性在于：（1）电活性的辅基位于蛋白质的中心；（2）蛋白质在电极表面的吸附变性；（3）蛋白质在电极表面的不利分子定向第64页,共85页，星期六，2024年，5月细胞色素c分子空间结构第65页,共85页，星期六，2024年，5月第66页,共85页，星期六，2024年，5月对于氧化还原蛋白质难以实现直接电子转移的主要原因有：一、通常情况下：（1）由于氧化还原蛋白质的辅基(生物活性基团常常为电化学活性基团)被多肽链所包裹,其与电极表面的距离较大,因而难于进行电子传递；（2）蛋白质在电极表面的取向往往不利于其电活性基团与电极之间的电子交换;（3）某些杂质在电极表面上的吸附或蛋白质本身的吸附变性可能阻碍它们与电极间的直接电子转移。第67页,共85页，星期六，2024年，5月二、氧化还原酶分为含有或不含电子传递通道两类,前者在自然体系中参与电子传递过程,其活性中心与酶分子表面之间存在电子传递通道;相反,后者不参与电子转移过程,所以在其分子中不存在电子传递通道，这类氧化还原酶很难实现直接电化学反应,除非它的氧化还原活性点位于酶分子表面三、氧化还原蛋白质结构复杂且具有各向异性,它们的活性中心并不正好位于蛋白的中心,此外蛋白质分子表面还呈现电荷分布不均匀性第68页,共85页，星期六，2024年，5月1977年,Hill和Kuwana分别发现马心细胞色素c(Cytc)与金电极和掺锡氧化铟电极之间有直接可逆的电化学反应。1979年,酶与电极的直接电子传递也见报道。这些开创性的工作为用电化学手段探索生物体系的奥秘打开了大门。近几十年来，人们对蛋白质直接电化学的研究主要集中在蛋白质固定在电极表面上的直接电化学响应。因为蛋白质在电极表面具有良好的取向是实现蛋白质－电极之间直接快速电子传递的前提。因此采用适当的方法在电极表面固定蛋白质,是目前蛋白质电化学研究的热点。第69页,共85页，星期六，2024年，5月但是大部分氧化还原酶的活性基团被外层的保护性蛋白质和糖原所包裹，无法与电极进行电子交换。Marcus方程给出了理论依据：其中?G是反应自由能；?是Marcus重组能；d是氧化还原中心实际电子传递距离(即酶氧化还原中心与电极或媒介体之间的距离)。从式可知，电子传递的动力学特性由以下因素决定：推动力、重组能、实际电子传递距离。氧化还原酶的分子量一般在40000(如：半乳糖酶)至850000(如：胆碱脱氢酶)Da(Dalton-道尔，一个氧原子质量的1/16)之间，它们的平均直径在55?～150?之间。通常，氧化还原酶很难与电极进行直接电子交换。第70页,共85页，星期六，2024年，5月2、酶直接电荷传输所采用的主要方法：（1）通过对酶的修饰形成电极转移接替体（Electron-transferrelay）-缩短电子隧道的距离；（2）使用电子转移促进剂；（3）酶固定在导电聚合物膜内的直接电化学；（4）酶在电极表面的规律定向吸附。第71页,共85页，星期六，2024年，5月A.蛋白质膜修饰电极B.蛋白质－溶胶/凝胶修饰电极C.蛋白质－表面活性剂膜修饰电极D.蛋白质－双层类脂膜修饰电极E.蛋白质－DNA膜修饰电极F.蛋白质－聚合物膜修饰电极G.蛋白质－纳米粒子修饰电极(1)基于蛋白质直接电子传递的修饰电极第72页,共85页，星期六，2024年，5月A.蛋白质膜修饰电极由Armstrong等创立的蛋白质膜伏安法(PFV)具有许多优点:(1)蛋白质膜电极的制备简单,需用蛋白质的量较小;(2)克服了溶液体系中蛋白质的扩散系数较小的限制;(3)能使用快速扫描伏安法研究电子传递过程;(4)通过电化学数据分析可获得丰富的生物化学信息。第73页,共85页，星期六，2024年，5月蛋白质膜修饰电极的制备:经过抛光的棱面裂解石墨电极(PEG)表面产生较多的亲水含氧基团。在低温(0°C)、低离子强度和共吸附剂(如氨基环多醇)的存在下,通过静电吸附作用,在电极表面形成一层蛋白质膜(吸附量10-11—10-12molcm-2)。共吸附剂在荷电的蛋白质和电极之间起着促进电子传递的作用。第74页,共85页，星期六，2024年，5月B.蛋白质－溶胶/凝胶修饰电极溶胶-凝胶法一般是以金属盐或半金属盐(硅酸甲脂TMOS，硅酸乙脂TBOS，钛酸丁脂等）为前驱体，在水，