生物制药酶类药物.ppt

酶的制剂形式：结晶：固体：干燥（冰冻升华，喷雾干燥，真空干燥）液体：低温（0-4℃，-20℃）提高酶蛋白的浓度加入稳定剂固定化第61页,共72页，星期六，2024年，5月保存：通常将纯化后的酶溶液经透析除盐后冷冻干燥得到酶粉，低温下可较长时期保存。也可将酶溶液制成25％甘油或50％甘油分别贮于—25℃或—50℃冰箱中保存。注意：酶溶液浓度越低越易变性，因此切记不能保存酶的稀溶液。第62页,共72页，星期六，2024年，5月酶的分离纯化工作中的注意事项1.防止酶蛋白变性2.防止辅因子丢失3.防止酶被蛋白水解酶降解第63页,共72页，星期六，2024年，5月采取的措施:1.避免泡沫的生成2.加入金属鏊合剂EDTA3.加入巯基试剂，如巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)等4.加入蛋白酶抑制剂第64页,共72页，星期六，2024年，5月衡量分离提纯方法优劣的指标:总活力的回收(表示提纯过程中酶的损失情况).比活力提高的倍数(表示提纯方法的有效程度)。第65页,共72页，星期六，2024年，5月总活力=活力单位数/ml酶液×总体积(m1)比活力=活力单位数/mg蛋白(氮)=总活力单位数/总蛋白(氮)mg纯化倍数=每次比活力/第一次比活力回收率(产率)=每次总活力/第一次总活力×100%第66页,共72页，星期六，2024年，5月二、酶活性测定（一）、酶活性1.酶活性或酶活力(Enzymeactivity)：在最适条件下(25?C,最适底物浓度和最适pH），酶催化一定化学反应的能力，以酶促反应速度表示。第67页,共72页，星期六，2024年，5月酶活性单位表示方法：酶活国际单位（IU)：在25?C最适条件下（最适pH，最适底物浓度），每分钟转化1μmol底物为产物的酶量。IU=1μmol/min.Katal（简称Kat）：在25?C最适条件下，每秒钟转化1mol底物为产物的酶量。1Kat=1mol/s.IU与Kat的换算1IU＝16.67×10-9Kat1Kat＝6×107IU1Kat＝109nKat第68页,共72页，星期六，2024年，5月注意：如果底物（S）有一个以上可被作用的化学键，则一个酶单位表示1分钟使1μmol有关基团转化的酶量。如果是两个相同的分子参加反应，则每分钟催化2μmol底物转化的酶量称为一个酶单位。在“U”和“kat”酶活力单位的定义和应用中，酶催化底物的分子量必须是已知的，否则将无法计算。第69页,共72页，星期六，2024年，5月2.酶的比活性（specificactivity）：指每mg蛋白所含的酶活性单位或每kg蛋白中所含的Kat数。比活性是表示酶制剂纯度的一个指标，对同一酶来说，比活性愈大，表示酶的纯度愈高。回收率=某纯化操作后的总活性/某纯化操作前的总活性［总活性=比活性×总体积（总重量）］比活性=总活性单位总蛋白mg数=U(或IU)mg蛋白第70页,共72页，星期六，2024年，5月（二）、测定酶活性的方法初速度法：在一个反应体系中，加入一定量的酶液，开始计时反应，经一定时间反应后，终止反应，测定在这一时间间隔内发生的化学反应量。平均速度法：在一定条件下，加入一定量底物（规定），再加入合适量的酶液，测定完成该反应（底物反应完）所需的时间。动态连续测定法：在反应体系中，加入酶，用仪器连续监测整个酶促反应过程中底物的消耗或产物的生成。第71页,共72页，星期六，2024年，5月感谢大家观看第72页,共72页，星期六，2024年，5月1.干燥法:干燥后菌体产生自溶（1）空气干燥:适用于热稳定的酶（2）真空干燥:适于细菌（3）冷冻干燥:适用于较敏感的酶2.机械法（1）研磨法（2）组织匀浆法（3）超声波法（4）高压匀浆法3.酶法处理第29页,共72页，星期六，2024年，5月(二)酶的提取1.水溶液法常用稀盐溶液或缓冲液提取。经过预处理的原料，包括组织糜，匀浆，细胞颗粒以及丙酮粉等，都可以用水溶液抽提。许多酶再蒸馏水中不溶解，而在低盐浓度下易溶解，所以提取时加入少量盐可提高酶的溶解度。第30页,共72页，星期六，2024年，5月2.有机溶剂法某些结合酶如微粒体和线粒体膜的酶，由于和脂质牢固结合，用水很