流式细胞检测技术讲座.ppt

FACSAria光学滤片检测器排列（激光器）光电倍增管BP滤光片可用染料八角形（488nm蓝色激光）A780/60PE-Cy7B695/40PerCP-Cy5.5,PerCPC610/20PE-TexasRedD575/26PEE530/30FITC三角形（633nm红色激光）A780/60APC-Cy7B660/20APC三角形（407nm紫色激光）A530/30AlexaFluor430B450/40CascadeBlue,PacificBlue,DAPI,Hoechst,AlexaFluor405第32页,共46页，星期六，2024年，5月荧光染色对照阳性对照使用已知阳性样本，帮助排除试剂的质量、浓度、特异性以及染色方法等因素阴性对照空白对照（自发荧光）自发荧光，即不经荧光染色细胞内部荧光分子经光照发出的荧光。自发荧光信号为噪声信号。一般说来，细胞成分中能产生自发荧光的分子（核黄素、细胞色素等）的含量越高，自发荧光越强，如肿瘤细胞、粒细胞等；样本死细胞比例越高，自发荧光越强。实验样本（自发荧光＋特异荧光＋非特异荧光）特异荧光，即抗体F(ab’)2段与细胞抗原特异结合上的荧光染料受光照发出的荧光非特异荧光，即抗体Fc段与细胞表面的Fc受体非特异结合上的荧光染料受光照发出的荧光同型对照（自发荧光＋非特异荧光）第33页,共46页，星期六，2024年，5月同型对照同型对照（IsotypeControl）：与实验染色的单克隆抗体特异性无关的免疫球蛋白亚型与染色的单克隆抗体①相同种属来源②相同免疫球蛋白及亚型③相同荧光素标记④相同剂量和浓度⑤但由未免疫动物血清纯化而来用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面的Fc受体而产生的背景染色例如，标记FITC的单克隆抗体为小鼠IgG1亚类抗体，标记PE的单克隆抗体为小鼠IgG2a亚类抗体，同型对照应用相同浓度和剂量的未免疫小鼠血清的纯化IgG1（γ1）和IgG2a（γ2a），并分别标记FITC和PE第34页,共46页，星期六，2024年，5月荧光染色补偿对照的设置补偿对照（双色或多色分析时）荧光补偿（compensation）是指在流式细胞多色分析中，纠正荧光素发射光谱重叠（spectraloverlap）的过程，即从一个被检测的荧光信号中去除任何其他的干扰荧光信号将单种荧光素标记的单克隆抗体分别进行单色荧光染色※几色分析就需要制备几个补偿对照管设置补偿的基本步骤：①上同型对照管，调节PMT电压，使阴性细胞群体处于双荧光散点图的左下角101道以内；②分别上单阳补偿管，依次调节相邻荧光的补偿设置，直至阳性和阴性细胞群处于最合适的位置第35页,共46页，星期六，2024年，5月双色荧光补偿第36页,共46页，星期六，2024年，5月双色荧光补偿第37页,共46页，星期六，2024年，5月双色荧光补偿第38页,共46页，星期六，2024年，5月双色荧光补偿第39页,共46页，星期六，2024年，5月实验设计实例分析类型管功能加入的抗体单色分析1Isotypeγ1-FITC2Sample1,2……A-FITC双色分析1Isotypeγ1-FITCγ2a-PE2Compensation1A-FITCγ2a-PE3Compensation2γ1-FITCB-PE4Sample1,2……A-FITCB-PE三色分析1Isotypeγ1-FITCγ2a-PEγ1-PerCP2Compensation1A-FITCγ2a-PEγ1-PerCP3Compensation2γ1-FITCB-PEγ1-PerCP4Compensation3γ1-FITCγ2a-PEC-PerCP5Sample1,2……A-FITCB-PEC-PerCP四色分析1Isotypeγ1-FITCγ2a-PEγ1-PerCPγ1-APC2Compensation1A-FITCγ2a-PEγ1-PerCPγ1-APC3Compensation2γ1-FITCB-PEγ1-PerCPγ1-APC4Compensation3γ1-FITCγ2a-PEC-PerCPγ1-APC5Compensation4γ1-FITCγ2a-PEγ1-Per