PCR扩增技术与琼脂糖凝胶电泳检测.pdf

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实验五PCR扩增技术与琼脂糖凝胶电泳检测

一、实验目的

1.掌握PCR扩增技术的基本原理

2.掌握PCR的常规操作

3.熟悉PCR反应体系中几种主要成分的作用

4.了解PCR技术的应用

5.掌握琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的方法

6.熟悉DNA在电泳过程中迁移率的决定因素

二、实验原理

1.PCR基本原理

聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用

于在体外快速扩增DNA，类似DNA的细胞内复制过程:由一对引物介导，通过温度的调

节，使双链DNA变性为单链DNA、单链DNA能与引物复性（退火）成为引物-DNA单链

复合物、以及在dNTPs存在下DNA聚合酶能使引物沿单链模板延伸成为双链DNA（引物

的延伸）；这种热变性-复性-延伸的过程，就是一个PCR循环；一般通过20-30个循环之

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后，就可获得大量（10倍）的要扩增的DNA片段。

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互

补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或

经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准

备；

②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左

右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应

原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链

互补的半保留复制链。

重复循环“变性—退火—延伸”三个过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种

新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的

基因扩增放大几百万倍。

2.PCR反应体系

标准PCR反应体系

10x扩增缓冲液10ul

4种dNTP混合液200ul

引物10~100ul

模版DNA0.1~2ug

TaqDNA聚合酶2.5ul

Mg2+1.5mmol/L

双蒸水100ul

3.琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定DNA片断的典型方法，其特点为简便、快速。

DNA片断琼脂糖凝胶电泳的原理与蛋白质的电泳原理基本相同，DNA分子在高于其等电

点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子在电场中通过介质而泳动，除

电荷效应外，凝胶介质还有分子筛效应，与分子大小及构想有关。对于线形DNA分子，

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其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比。在凝胶中加入少量溴化乙锭（有毒！），

其分子可插入