DB51T 1420-2012 动物细粒刺球蚴检疫技术规范 全血金标免疫渗滤法.docxVIP

ICS11.220B41

DB51

四川省地方标准

DB51/T1420—2012

动物细粒棘球蚴检疫技术规范——全血金标免疫渗滤法

2012-03-30发布2012-05-01实施

四川省质量技术监督局发布

DB51/T1420—2012

目次

前言 II

1范围 1

2规范性引用文件 1

3术语和定义 1

4检测方法 2

附录A(资料性附录)试剂的配制方法 4

附录B(资料性附录)细粒棘球蚴囊液粗抗原制备 5

参考文献 6

工

II

DB51/T1420—2012

前言

本标准由四川出入境检验检疫局提出并归口。本标准由四川省质量技术监督局批准发布。

本标准起草单位：四川出入境检验检疫局、四川农业大学。

本标准主要起草人：余华、杨光友、严玉宝、胡娟、崔鹏博、周岷江。

1

DB51/T1420—2012

动物细粒棘球蚴检疫技术规范——全血金标免疫渗滤法

1范围

本标准规定了动物细粒棘球蚴的检疫技术方法。

本标准适用于动物细粒棘球蚴的全血金标免疫渗滤法检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

NY/T541动物疫病实验室检验采样方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本标准

3.1

细粒棘球蚴Echinococcosisgranulosa

指细粒棘球绦虫(Echinococcusgranulosus)的中绦期幼虫，它寄生于牛、羊等动物及人的肝脏和肺脏等部位，可引起动物和人的严重寄生虫病，即棘球蚴病(Hydatidosis)或称包虫病。

3.2

全血金标免疫渗滤法DIGFA

是一种检测全血标本的棘球蚴现场快速检测方法，它以硝酸纤维素膜为载体，利用微孔滤膜的可滤过性，使抗原抗体反应和洗涤在一特殊的渗滤装置上以液体渗滤过膜的方式迅速完成。全血金标免疫渗滤法方法是采用土豆凝集素与全血混合达到快速凝血的目的。

4检测方法

4.1试剂和材料

以下所用的试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂；水为符合GB/T6682规定的二级水。

DB51/T1420—2012

2

氯金酸；

抗检测动物IgG二抗；

三羟甲基氨基甲烷(Tris);

塑料小盒；吸水垫料；

硝酸纤维素膜(NC膜);碳酸钾；

土豆凝集素；

5%的BSA封闭液，配制见附录A.5;PBS缓冲液，配制见附录A.6;

PBST洗涤液，配制见附录A.7;

受检动物细粒棘球蚴抗体阳性血清；受测动物细粒棘球蚴抗体阴性血清；

硫酸铵沉淀法纯化的细粒棘球蚴囊液抗原(0.2mg/mL),配制见附录B。

4.2仪器和设备

高速冷冻离心机；移液枪；

核酸蛋白仪；

紫外分光光度计；金标喷点仪。

4.3检测步骤

4.3.1待检血样

按照NY/T541“样品的采集”有关章节要求，采集每头待检动物全血5mL,加入0.01%的土豆凝集素(50μL),室温(20℃~26℃条件下操作)备用。

4.3.2胶体金-抗抗体制备

4.3.2.1试剂配制

0.01%氯金酸溶液配制见A.1;1%的柠檬酸三钠溶液配制见A.2;0.1moL/HCL配制见A.3。

4.3.2.2制备方法

取0.01%氯金酸溶液100mL加热煮沸后，在剧烈搅拌下加入1%的柠檬酸三钠溶液3mL。待溶液变成葡萄酒红色后继续煮10min,冷却后以0.1moL/HCL调节pH至6.0,将抗抗体按照1:40的浓度加入胶体金中。迅速混匀10min后，加入1%的PEG(MV10000)使其浓度为0.05%,3000r/min离心5min,取上清12000r/min离心20min,弃上清，沉淀混悬于含1%BSA的PBS中，即为胶体金抗抗体结合物。

3

DB51/T1420—2012

4.3.3诊断膜制备

硝酸纤维素膜(NC膜)(孔径0.3μm)用超纯水浸泡30min,取出晾干后用铅笔在膜上画出1cm见方的方格，用pH